Observation af befrugtede embryoner til embryoklipning
Siden den første kaninembryokultur blev beskrevet i 1912, og zygoter af mus kunne dyrkes in vitro for at danne embryoner på blastocyststadiet, er embryokvaliteten blevet en vigtig faktor for graviditet efter overførsel af in vitro-embryoner til livmoderen, fordi embryokvaliteten har en tæt sammenhæng med den overførte embryos implantation i livmoderen. Siden fødslen af det første reagensglasbarn, Louise Brown i juli 1978, for hvilken Robert Edwards i 2010 fik Nobelprisen i fysiologi eller medicin for at have udviklet in vitro-befrugtning (IVF) og embryooverførsel (ET) til behandling af infertilitet hos kvinder med uoplagte æggeledere, har in vitro-embryoproduktion (IVP) været meget anvendt til behandling af infertilitet hos mennesker og til reproduktion og udvidelse af dyrepopulationer. Succesen af assisteret reproduktionsteknologi afhænger imidlertid hovedsagelig af, at der produceres levedygtige embryoner med et højt implantationspotentiale. Endnu vigtigere er det at vælge det bedste embryon til overførsel blevet den største udfordring ved IVF. I den tidlige embryokultur var vurderingen af embryokvaliteten hovedsagelig baseret på de morfologiske kriterier for det overførte embryon. Derfor er seriel observation af embryomorfologien en almindelig teknik for embryologer til at vurdere embryoner og er blevet betragtet som en vigtig forudsigelse af implantation og graviditet . I lang tid har embryologer foretaget vurderinger af embryonernes kvalitet og morfologi ved at tage embryonerne ud af inkubatoren og lægge dem under et mikroskop. Ud over morfologiobservation er forskerne interesseret i en række undersøgelser af cellekerneforandringer, genaktivering og -ekspression, cytoplasmatisk proteinekspression, blastomerdifferentiering osv. Disse undersøgelser resulterer imidlertid ofte i embryonernes død. I vores tidlige undersøgelse, som observerede mikrospindelforandringer efter sædcellernes indtrængen i ægget eller aktivering af oocytten, skulle de befrugtede zygoter eller aktiverede æg fikseres på objektglasset og farves med immuncytokemisk fluorescein og laserkonfokal mikroskopi . Vores forskning viste tydeligt ændringen af mikrotubuli og kromatin efter aktivering af bovin oocyt og introcytoplasmisk sædinjektion (ICSI; figur 1). Sædcellerne i oocyten eller calciumionoforen og ethanol kan aktivere oocyten og forårsage ekstrudering af det andet polære legeme. For at observere tidspunktet for det andet polære legeme farvede vi forskellige stadier af oocytter efter aktivering. Resultatet viste, at efter 5 timers postaktivering kan det andet pollegeme være helt ekstruderet (figur 2).
Figur 1.
Laser-scanning konfokal mikroskopi af spindel- og kromatinændringer på de forskellige tidspunkter efter aktivering og intracytoplasmatisk sædinjektion (ICSI) hos kvæg. Store bogstaver (venstre) angiver ændringen efter aktivering og små bogstaver (højre) angiver ændringen efter ICSI. A/a viste 0,5 timer, B/b er 2 timer, C/c er 3 timer, og D/d er 7 timer efter aktivering eller ICSI. Prænucleus i aktiveret æg og prænuclei i ICSI-æg er dukket op med rød farve.
Figur 2.
Laser-scanning konfokal mikroskopi af spindel- og kromatinændringer på de forskellige tidspunkter efter aktivering i kvæg. 0,5 timer efter aktivering begynder kromosomerne i spindlen at dele sig, og spindeldelingen skal være afsluttet efter ca. 3 timer, og det andet polære legeme kan udtrækkes efter ca. 5 timer. Den røde og grønne farve angiver sammen spindlen, og det røde punkt angiver det første pollegeme.
For at studere genekspression er det ofte nødvendigt at isolere mRNA eller protein fra embryoner; derfor skulle embryoner lyseres, og intet embryon ville overleve. For at studere celledifferentieringen på embryoner i moral- og blastocyststadiet er der anvendt en metode med dobbeltfarvning med fluoresceinmikroskopi til at skelne mellem indre cellemasse (ICM) og trophoectoderm (TE). Antallet af to forskellige celler kan tælles ud fra forskellige farver (ICM som blå og TE som lyserød, figur 3).
Figur 3.
Distinktion af forskellige celler i bovine blastocystembryoner med dobbeltfarvning. Den øverste figur viser et blastocystembryo med markeret indre cellemasse (ICM) og omkring trophectodermceller (TE). Nederste figur viser dobbeltfarvet blastocystembryo fra kvæg med blå som ICM og pink som TE-celler. Billedet øverst er fra søgning på en webside, og forfatteren sætter stor pris på professor Fuliang Du’s høflighed for det upublicerede nederste foto.
Disse forskningsmetoder skader i sidste ende alle embryoner, og det er umuligt at anvende disse metoder i klinisk praksis. Derfor er den nuværende vurdering af embryokvaliteten primært baseret på de morfologiske kriterier for overførte embryoner, som omfatter tre hovedparametre såsom blastomere regelmæssighed, fragmentering og cytoplasmatisk granularitet . Også antallet af embryoceller på forskellige dyrkningsdage og flerkernighed kan tages i betragtning ved vurderingen af embryokvaliteten . Adskillige rapporter har dokumenteret sammenhængen mellem morfologiske karakteristika ved embryoner i kløvningsstadiet og graviditetssucces. Dette er således i øjeblikket den grundlæggende metode til vurdering af embryokvaliteten i forbindelse med IVF på mennesker og in vitro-embryoproduktion på dyr. Selv om denne metode er let at anvende, tages embryoner ofte ud af inkubatoren, hvilket giver anledning til bekymring for sikkerheden og stabiliteten af dyrkningsbetingelserne . Desuden kan nogle vigtige punkter i den embryonale udvikling overses under observationen. Evaluering af spaltningsembryoner under dyrkning og før embryooverførsel er en vigtig klinisk praksis. I øjeblikket er den vigtigste vurdering af in vitro befrugtede embryoner en visuel observation ved hjælp af mikroskopi. I de seneste år er der blevet anvendt forskellige tidsforløbsmikroskopiinkubatorer på IVF-klinikker for mennesker til at overvåge alle trin i embryonets vækst og udvikling. Selv om teknologi til præimplantationsdiagnostik og -screening af embryoner (PGD/PGS) er blevet anvendt i praksis for udvælgelse af humane embryoner for at forbedre graviditetsraten, er disse teknikker invasive for embryoner. Det vil være meget nyttigt at finde en anden ikke-invasiv metode til at udvælge et godt embryon inden for human ART-praksis. Sallam et al. gennemgik ikke-invasive metoder til udvælgelse af embryoner og evaluerede disse metoder i lyset af den bedste foreliggende dokumentation for at finde ud af, om nogen af dem er modne til at erstatte eller supplere den hævdvundne metode med morfologisk vurdering. Vi har således brug for mere effektive værktøjer til at vurdere embryoners morfokinetiske markører.
2.1. Morfokinetik for embryoklipning baseret på time-lapse-billeddannelse
I årtier har forskere forsøgt at følge udviklingen af flercellede organismer fra befrugtede æg til voksne organismer. Selv om forskerne havde udforsket de enkelte trin i denne proces, fandtes der ingen metode, der gjorde det muligt for dem at modellere hele udviklingsprocessen live. På nuværende tidspunkt har fremskridt inden for lys-ark-mikroskopi, der er rapporteret i to Nature Methodspapers, gjort det muligt for forskere at visualisere tidlig udvikling i stor detalje . Nyere lys-ark-mikroskoper bruger et ark af laserlys til at belyse et tyndt snit af en prøve og fange hele planet i et enkelt øjebliksbillede. Dette gør det muligt for dem at bruge meget mindre lys end konfokale eller to-fotonmikroskoper. Det er meget hurtigt, men også meget skånsomt for at yde ekstremt godt på flere kritiske måder på samme tid . Til billeddannelse af udviklingen af hele embryoner som f.eks. hos Drosophila, zebrafisk og mus er denne nye multiview-billeddannelsesteknik fantastisk.
Time-lapse-billeddannelse er en anden ikke-invasiv, ny teknologi, der giver mulighed for 24-timers overvågning af embryonernes udvikling, hvilket giver mulighed for øget mængde og kvalitet af morfologiske oplysninger uden at forstyrre kulturtilstanden . Time-lapse-mikroskopet er meget nyttigt til observation af embryonernes udvikling. I det sidste årti er mange IVF-klinikker eller -centre begyndt at anvende tidsforløbsbilleder til at overvåge embryonernes vækst og deling under in vitro-kultur og endelig til at udvælge embryoner af god kvalitet til overførsel på grundlag af registrerede data og billeder. Det er blevet rapporteret, at denne teknik er i stand til at forbedre implantation og graviditet af overførte embryoner. På grundlag af tidsforløbsoptagelser af embryonernes spaltning kan den normale spaltningshastighed for embryoner bestemmes. I det andet kapitel i denne bog er timingen af embryonets spaltning således blevet skitseret på grundlag af morfokinetiske markører ved hjælp af time-lapse-monitoren. I henhold til denne tidsplan for embryonens spaltning kan embryologer klart vide, på hvilket stadium et embryon bør befinde sig på forskellige tidspunkter. Dermed kan et embryon af optimal kvalitet eller et embryon med højt potentiale for implantation udvælges til overførsel for at opnå en højere graviditetsrate. Ved hjælp af et system til kontinuerlig og hyppig registrering af tidsforløb kan nogle morfokinetiske markører afsløres i tidsforløbssystemet. F.eks. resulterer en hurtig deling af embryocellerne på et givet tidspunkt ofte i en lavere implantationsrate. I den normale situation kræver delingen fra zygote til 2-3 celler ca. 10-11 timer, men Rubio et al. fandt, at nogle embryoner kun bruger ca. 5 timer på at gennemføre denne deling, og disse embryoner har en meget lavere implantationsrate end embryoner med normal deling (1,2 % mod 20 %). Også ulige spaltning af embryoner, der defineres som en opsplitning af en blastomer i tre datterblastomer eller et interval i cellecyklus på mindre end 5 timer giver ofte et betydeligt lavere implantationspotentiale . Vi kan således bruge disse mere præcise morfokinetiske markører til at skelne mellem embryokvaliteten.
Det tredje kapitel undersøger og verificerer yderligere, om time-lapse-billedteknologi er nyttig til udvælgelse af embryoner af “topkvalitet” til overførsel for at forbedre ART-resultatet i stedet for konventionel morfologisk evaluering. Interessant nok er de mulige sammenhænge mellem embryonets køn, embryofragmentering, behandlingsprotokoller, forskellige kulturmedier og embryonets morfokinetik blevet evalueret på grundlag af nogle nye undersøgelser af tidsforløbsbilleder. Desuden drøftes også forskellige algoritmer og forudsigelsesmodeller, der er udviklet i ART-cyklusser med tidsforløbsbilleder. F.eks. viste mange undersøgelser af dyrs og menneskers embryonale udviklingshastighed ved hjælp af almindelig morfologisk observation, at hanembryoner vokser hurtigere end hunembryoner . Den nuværende observation med tidsforløbsbilleder kan imidlertid give mere detaljerede og nøjagtige oplysninger om forskellen mellem han- og hunembryoner under de tidlige delinger. Selv om kvindelige embryoner viste sene morfokinetiske parametre for morfokinetisk spaltning (t8), morula (tM) og blastocyststadiet, viste de tidligere ekspansion end hanner. Således er de vigtigste tidspunkter for observation relateret til embryonernes kønsudvikling. Interessant nok designede forfatterne en model i henhold til tidspunktet for anden synkronisering og morula-dannelse med fire undergrupper for at forudsige sandsynligheden for, at et embryon er hunkøn.
For at yderligere studere og udforske morfokinetikken af embryonkløvning diskuterer det fjerde kapitel nogle metoder til rumtemporal analyse af embryonkløvning in vitro.Automatiseret eller halvautomatiseret time-lapse-analyse af billeder af tidlige embryoner i spaltningsstadiet kan give indsigt i mitosetidspunktet, regelmæssigheden af både delingstidspunktet og -mønsteret samt i cellelinjen. Samtidig overvågning af molekylære processer gør det muligt at undersøge forbindelserne mellem genetisk ekspression og cellens fysiologi og udvikling. Ved hjælp af time-lapse-billeddata og analytisk software kan der let skabes en fire-dimensional videosekvensering af embryoner, således at voksende embryoner viser ny indsigt i embryonernes udvikling i tidsmæssig sammenhæng. I dette kapitel beskriver forfatterne tre metoder med variationer i hardware- og softwareanalyse ved at give nogle eksempler på resultaterne for at åbne et vindue til nye oplysninger inden for udviklingsembryologi, idet embryonernes delingsmønster og afstamning studeres in vivo.
2.2. Genekspression af spaltningsembryo og ikke-invasiv vurdering af embryonets levedygtighed via kulturmedieanalyse
Preimplantationsembryonets udvikling oplever en række kritiske begivenheder og bemærkelsesværdige epigenetiske modifikationer, og der sker en omprogrammering af genekspressionen for at aktivere det embryonale genom. I de tidlige stadier af præimplantationsembryoets udvikling styrer moderens mRNA’er den embryonale udvikling. Gennem hele den tidlige embryonale udvikling opretholdes et differentieret methyleringsmønster, selv om nogle af dem viser stadiespecifikke ændringer. Nylige undersøgelser har vist, at differentieret demethyleringsproces resulterer i differentieret moderens genekspression i de tidlige embryoner under udvikling, hvilket kan have en indvirkning på den korrekte udvikling. Det er også blevet påvist, at ikke-kodende RNA’er, lange ikke-kodende RNA’er (lncRNA) og korte ikke-kodende RNA’er, mikroRNA’er (miRNA’er), spiller en vigtig rolle i reguleringen af mRNA’er, og derfor har deres rolle i præimplantationsudviklingen fået større betydning. Kapitel fem gennemgår de forskellige faktorer, der påvirker genekspressionen under præimplantationsembryonernes udvikling, hvilket omfatter epigenetiske faktorer, med fokus på methyleringsprofiler, i gameter og præimplantationsembryoner. Virkningerne af ikke-kodende RNA’er på genekspressionen blev grundigt evalueret.
Da genekspressionen fremtræder under embryonets udvikling i in vitro-kultur, kræver præimplantationsembryoner ofte kulturmedier med rig næring. Embryoet har under sin vækst og udvikling brug for at absorbere nogle vigtige næringsstoffer fra kulturmediet og metabolisk producere nogle biprodukter som genekspressionsresultater. Ud fra dette synspunkt giver in vitro-dyrkning af embryoner også et meget vigtigt materiale til yderligere ikke-invasiv evaluering af embryoner ved hjælp af undersøgelse af biomarkører i det brugte embryokulturmedium. De nuværende udviklede metoder er koncentreret om måling af metaboliske forbindelser, der udskilles fra embryoner under udvikling. I disse undersøgelser anvendes hovedsagelig moderne analytiske og proteomiske værktøjer. Nogle undersøgelser tyder på, at metabolisk profilering af embryokulturmedier ved hjælp af optiske og ikke-optiske spektroskopier kan udgøre et nyttigt supplement til de nuværende strategier til vurdering af embryoner og give indsigt i fænotypen af embryoner med stigende reproduktionspotentiale .
I det sjette kapitel beskriver forfatterne deres nye opdagelse, alfa-1-kæden af det humane haptoglobinmolekyle som en kvantitativ biomarkør for embryonets levedygtighed. I en række retrospektive, blinde eksperimenter opnåede de en succesrate på over 50 %. Dette kapitel opsummerer de i øjeblikket tilgængelige metaboliske og proteomiske metoder til ikke-invasiv molekylær vurdering af embryonets levedygtighed. Nylige undersøgelser viste, at vurderingen af de molekylære komponenter i næringsmedier er et lovende område i forbindelse med søgning efter markører for en vellykket embryoimplantation med efterfølgende udvikling af en klinisk graviditet og fødslen af et sundt barn for at øge effektiviteten af behandlingen ved hjælp af ART-teknikker . Hvis den molekylære sammensætning af dyrkningsmedier kan bruges som en yderligere ikke-invasiv procedure til at vælge et embryon til selektiv overførsel, vil det være meget nyttigt for at forbedre resultatet af IVF-graviditet hos mennesker.