Fluorescens

Fluorescens er en luminescens, der oftest findes som et optisk fænomen i kolde legemer, hvor den molekylære absorption af en foton ved en bestemt bølgelængde udløser emissionen af en anden foton med en længere bølgelængde. Det stof, der fluorescerer, kaldes en fluorofore. Energiforskellen mellem de absorberede og udsendte fotoner ender som molekylære vibrationer eller varme. Normalt ligger den absorberede foton i det ultraviolette område og det udsendte lys i det synlige område, men dette afhænger af den anvendte fluorofore og andre faktorer.

Fluorescens er opkaldt efter mineralet fluorit, der består af calciumfluorid, som ofte udviser dette fænomen. En række andre mineraler og organiske materialer er også fluorescerende, og de anvendes til en række forskellige formål. F.eks. er fluorescens nyttig til belysning og mærkning af molekyler i analytisk kemi og biokemi. Fluorophorer er blevet brugt til at mærke celler, antistoffer og andre biologiske strukturer og til at bestemme deres struktur og virkemåde.

Eksempler på fluorescerende materialer

Emmersten, mineraler, fibre og mange andre materialer, som man støder på i retsmedicinske undersøgelser eller med relation til forskellige samlerobjekter, kan have en karakteristisk fluorescens eller kan fluorescere forskelligt under kortbølget ultraviolet, langbølget ultraviolet eller røntgenstråler.

Mange typer calcit og rav vil fluorescere under kortbølget UV. Rubiner, smaragder og Hope-diamanten udviser rød fluorescens under kortbølget UV-lys; diamanter udsender også lys under røntgenstråling.

Råolie (petroleum) fluorescerer i en række farver, fra kedelig brun for tunge olier og tjære til lysende gullig og blålig hvid for meget lette olier og kondensater. Dette fænomen anvendes ved olieefterforskningsboringer til at identificere meget små mængder af olie i boreudskæring og kerneprøver.

Organiske væsker som f.eks. blandinger af antracen i benzen eller toluen eller stilben i de samme opløsningsmidler fluorescerer ved bestråling med ultraviolette eller gammastråler. Afbrydelsestiderne for denne fluorescens er i størrelsesordenen nanosekunder, da lysets varighed afhænger af levetiden for de exciterede tilstande i det fluorescerende materiale, i dette tilfælde antracen eller stilben.

Anvendelser

Der er mange naturlige og syntetiske forbindelser, der udviser fluorescens, og de har en række anvendelser. Nogle dybhavsdyr, som f.eks. grønspætte, bruger fluorescens.

Belysning

Det almindelige fluorescerende rør er afhængig af fluorescens. Inde i glasrøret er der et delvist vakuum og en lille mængde kviksølv. En elektrisk udladning i røret får kviksølvatomerne til at udsende lys. Det udsendte lys er i det ultraviolette (UV) område, er usynligt og er skadeligt for de fleste levende organismer. Røret er foret med en belægning af et fluorescerende materiale, kaldet fosfor, som absorberer det ultraviolette lys og genudsender synligt lys. Fluorescerende belysning er meget energieffektiv i forhold til glødeteknologi, men de producerede spektrer kan få visse farver til at virke unaturlige.

I midten af 1990’erne kom hvide lysdioder (LED) på markedet, som fungerer efter en lignende proces. Typisk producerer den egentlige lysemitterende halvleder lys i den blå del af spektret, som rammer en fosforforbindelse, der er deponeret på chippen; fosforen fluorescerer fra den grønne til den røde del af spektret. Kombinationen af det blå lys, der går gennem fosforen, og det lys, der udsendes af fosforen, giver en nettoemission af hvidt lys.

Den moderne kviksølvdampgadelampe siges at være udviklet fra lysstofrørslampen.

Glødpinde oxiderer phenyloxalatester for at producere lys.

Kompaktlysstofrør (CFL) er det samme som enhver typisk lysstofrørslampe med fordele. Det er selvforsynet og anvendes til at erstatte glødepærer i de fleste anvendelser. De producerer en fjerdedel af varmen pr. lumen som glødepærer og holder ca. fem gange så længe. Disse pærer indeholder kviksølv og skal håndteres og bortskaffes med omhu.

Analytisk kemi

Fluorescens i flere bølgelængder kan detekteres af en array-detektor, for at detektere forbindelser fra HPLC-flow. Desuden kan tyndtlagskromatografiske (TLC) plader visualiseres, hvis forbindelserne eller et farvestofreagens er fluorescerende.

Fingeraftryk kan visualiseres med fluorescerende forbindelser såsom ninhydrin.

Biokemi og medicin

Biologiske molekyler kan mærkes med en fluorescerende kemisk gruppe (fluorofore) ved en simpel kemisk reaktion, og fluorescensen af mærket muliggør følsom og kvantitativ detektion af molekylet. Eksempler herpå:

• Fluorescensmikroskopi af væv, celler eller subcellulære strukturer opnås ved at markere et antistof med en fluorofor, så antistoffet kan finde sit målantigen i prøven. Ved at mærke flere antistoffer med forskellige fluorophorer kan man visualisere flere mål i et enkelt billede.
• Automatiseret sekventering af DNA ved hjælp af kædeafslutningsmetoden; hver af de fire forskellige baser, der afslutter kæden, har sit eget specifikke fluorescerende mærke. Når de mærkede DNA-molekyler adskilles, ophidses det fluorescerende mærke af en UV-kilde, og identiteten af den base, der afslutter molekylet, identificeres ved hjælp af bølgelængden af det udsendte lys.
• DNA-detektion: forbindelsen ethidiumbromid har meget lidt fluorescens, når den frit kan ændre sin konformation i opløsning. Ethidiumbromids fluorescens forstærkes kraftigt, når det binder sig til DNA, så denne forbindelse er meget nyttig til at visualisere DNA-fragmenters placering i agarosegelelektroforese. Ethidiumbromid kan være giftigt; et mere sikkert alternativ er farvestoffet SYBR Green.
• DNA-mikroarrayet
• Immunologi: Et antistof har en fluorescerende kemisk gruppe tilknyttet, og de steder (f.eks. på en mikroskopisk prøve), hvor antistoffet er bundet, kan ses og endda kvantificeres ved hjælp af fluorescensen.
• FACS (fluorescerende aktiveret cellesortering)
• Fluorescens er blevet brugt til at studere DNA’s og proteiners struktur og konformationer med teknikker som f.eks. fluorescensresonansenergioverførsel, der måler afstanden på angstromniveau. Dette er især vigtigt i komplekser af flere biomolekyler.
• Aequorin, fra vandmanden Aequorea victoria, producerer et blåt skær i tilstedeværelse af Ca2+-ioner (ved en kemisk reaktion). Det er blevet brugt til at afbilde calciumstrømmen i celler i realtid. Succesen med aequorin ansporede til yderligere undersøgelser af A. victoria og førte til opdagelsen af Green Fluorescent Protein (GFP), som er blevet et yderst vigtigt forskningsredskab. GFP og beslægtede proteiner anvendes som rapporteringsindikatorer for en lang række biologiske hændelser, herunder f.eks. subcellulær lokalisering. Niveauer af genekspression måles undertiden ved at koble et gen til GFP-produktion til et andet gen.

Dertil kommer, at mange biologiske molekyler har en iboende fluorescens, som undertiden kan anvendes uden at der er behov for at vedhæfte et kemisk tag. Nogle gange ændrer denne iboende fluorescens sig, når molekylet befinder sig i et bestemt miljø, så molekylets fordeling eller binding kan måles. Bilirubin er f.eks. stærkt fluorescerende, når det er bundet til et specifikt sted på serumalbumin. Zinkprotoporphyrin, der dannes i røde blodlegemer under udvikling i stedet for hæmoglobin, når jern ikke er tilgængeligt eller bly er til stede, har en lys fluorescens og kan bruges til at påvise disse problemer.

I 2006 er antallet af fluorescensanvendelser stigende inden for biomedicinsk biologisk og beslægtede videnskaber. Analysemetoderne inden for disse områder vokser også, om end med en stadig mere uheldig nomenklatur i form af akronymer som f.eks: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. De fleste af disse teknikker er afhængige af fluorescensmikroskoper. Disse mikroskoper anvender højintensitetslyskilder, normalt kviksølv- eller xenonlamper, LED’er eller lasere, til at fremkalde fluorescens i de observerede prøver. Optiske filtre adskiller derefter excitationslyset fra den udsendte fluorescens, som kan detekteres med øjet eller med et (CCD)-kamera eller andre lysdetektorer (fotomultiplikatorrør, spektrografer osv.). Der er meget forskning i gang for at forbedre mulighederne i sådanne mikroskoper, de anvendte fluorescerende prober og de anvendelser, de anvendes til. Særligt bemærkelsesværdige er de konfokale mikroskoper, som anvender et pinhole til at opnå optisk sektionering – hvilket giver et kvantitativt, tredimensionelt billede af prøven.

Sikkerhed

Lysstofrør skaber langt mindre spildvarme end gløde- og halogenpærer. Halogenpærer er involveret i et stort antal brande, og glødepærer indebærer også en større risiko for brand end lysstofrør pga. spildvarme. Lamper kan vælte ved et uheld eller undertiden ved begivenheder som f.eks. jordskælv. Anvendelse af lysstofrør kan således være et middel til at forebygge utilsigtede brande. Lysstofrør kan dog indeholde kviksølv, og hvis en sådan pære går i stykker, kan det medføre et dyrt kviksølvudslip.

Theoretiske overvejelser

Fotokemi

Fluorescens opstår, når et molekyle eller en kvantepunkt slapper af til sin grundtilstand efter at være blevet elektronisk exciteret.

Eksponering: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \to S_{1}}}

Fluorescens (emission): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } , her h ν {\displaystyle h\nu } er et generisk udtryk for fotonenergi, hvor: h = Plancks konstant og ν {\displaystyle \nu } = lysets frekvens. (De specifikke frekvenser for spændende og udsendt lys afhænger af det pågældende system.)

Status S0 kaldes fluorophorens (det fluorescerende molekyls) grundtilstand, og S1 er dens første (elektronisk) exciterede tilstand.

Et molekyle i sin exciterede tilstand, S1, kan slappe af ad forskellige konkurrerende veje. Det kan undergå “ikke-radiativ afslapning”, hvor excitationsenergien spredes som varme (vibrationer) til opløsningsmidlet. Exciterede organiske molekyler kan også slappe af via omdannelse til en triplettilstand, som efterfølgende kan slappe af via fosforescens eller via et sekundært ikke-radiativt relaxationstrin.

Relaxation af en S1-tilstand kan også ske gennem interaktion med et andet molekyle via fluorescensdæmpning. Molekylær oxygen (O2) er en ekstremt effektiv quencher af fluorescens på grund af sin usædvanlige triplet grundtilstand.

Molekyler, der er exciteret gennem lysabsorption eller via en anden proces (f.eks. som produkt af en reaktion), kan overføre energi til et andet ‘sensibiliseret’ molekyle, som omdannes til sin exciterede tilstand og derefter kan fluorescere. Denne proces anvendes i lysstave.

Fluorescenskvanteudbytte

Fluorescenskvanteudbyttet angiver effektiviteten af fluorescensprocessen. Det defineres som forholdet mellem antallet af udsendte fotoner og antallet af absorberede fotoner.

Φ = # p h o t o n s e m i t t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\\rm {\##\ fotoner\ udsendt}}{\rm {\#\#\ fotoner\ absorberet}}}}

Det maksimale fluorescenskvanteudbytte er 1,0 (100 procent); hver absorberet foton resulterer i en udsendt foton. Forbindelser med et kvanteudbytte på 0,10 anses stadig for at være ret fluorescerende. En anden måde at definere kvanteudbyttet af fluorescens på, er ved hjælp af hastighederne for henfald af exciterede tilstande:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

hvor k f {\displaystyle {\displaystyle {k}_{f}}} er hastigheden af spontan emission af stråling og

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{k}_{i}}

er summen af alle hastigheder for henfald af exciterede tilstande. Andre hastigheder for henfald af exciterede tilstande skyldes andre mekanismer end fotonemission og kaldes derfor ofte “ikke-radiative hastigheder”, som kan omfatte: dynamisk kollisionsdæmpning, dipol-dipol-interaktion i nærfeltet (eller resonansenergioverførsel), intern omdannelse og intersystemovergang. Hvis hastigheden for en af vejene ændres, vil dette således påvirke både den exciterede tilstands levetid og fluorescenskvanteudbyttet.

Fluorescenskvanteudbyttet måles ved sammenligning med en standard med kendt kvantologi; kininsaltet, kininsulfat, i en svovlsyreopløsning er en almindelig fluorescensstandard.

Fluorescenslevetid

Fluorescenslevetiden henviser til den gennemsnitlige tid, som molekylet opholder sig i sin exciterede tilstand, før det udsender en foton. Fluorescens følger typisk første ordens kinetik:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

hvor {\displaystyle \left} er koncentrationen af molekyler i exciteret tilstand på tidspunkt t {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} er den oprindelige koncentration og Γ {\displaystyle \Gamma } er henfaldshastigheden eller den inverse af fluorescenslevetiden. Dette er et eksempel på eksponentiel henfald. Forskellige strålende og ikke-strålende processer kan affolke den eksiterede tilstand. I så fald er den samlede henfaldshastighed summen over alle hastigheder:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}

hvor Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} er den samlede henfaldshastighed, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} den strålingsmæssige henfaldshastighed og Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} den ikke-radiative henfaldshastighed. Det svarer til en kemisk reaktion af første orden, hvor første ordens hastighedskonstant er summen af alle hastighederne (en parallel kinetisk model). Hvis den spontane emissionshastighed eller en af de andre hastigheder er hurtig, er levetiden kort. For almindeligt anvendte fluorescerende forbindelser ligger de typiske henfaldstider i exciteret tilstand for fluorescerende forbindelser, der udsender fotoner med energier fra UV- til nærinfrarødt lys, i intervallet 0,5 til 20 nanosekunder. Fluorescenslevetiden er en vigtig parameter for praktiske anvendelser af fluorescens som f.eks. fluorescensresonansenergioverførsel.

Regler

Der er flere regler, der omhandler fluorescens. Kasha-Vavilov-reglen dikterer, at kvanteudbyttet af luminescens er uafhængigt af bølgelængden af den spændende stråling.

Denne regel er ikke altid gyldig og overtrædes alvorligt i mange simple molekyler. Et noget mere pålideligt udsagn, omend stadig med undtagelser, er, at fluorescensspektret viser meget lille afhængighed af bølgelængden af den exciterende stråling.

Se også

• Fluorescein
• Fluorescenslampe
• Lys
• Phosphorescens
• Røntgen

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Moderne molekylær fotokemi. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molekylær fluorescens: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Alle links hentet den 14. april 2017.

• Fluorophorer.org The database of fluorescent dyees
• Fluorescence on Scienceworld
• Basic Concepts in Fluorescence