Fase 1 klinisk forsøg med Trametes versicolor hos kvinder med brystkræft

Abstract

Introduktion. Oralt indgivne præparater fra svampen Trametes versicolor (Tv) er blevet antaget at kunne forbedre immunresponset hos kvinder med brystkræft efter standard kemoterapi og strålebehandling. Metoder. Der blev foretaget en fase I-undersøgelse med dosiseskalering på to centre for at bestemme den maksimalt tolererede dosis af et Tv-præparat, når det indtages dagligt i opdelte doser i 6 uger efter nylig afsluttet strålebehandling. Elleve deltagere blev rekrutteret, og ni kvinder gennemførte undersøgelsen. Hver kohorte bestod af tre deltagere, der fik en af tre doser af Tv (3, 6 eller 9 gram). Immundata blev indsamlet før og efter bestråling, på 3 tidspunkter under behandlingen og efter 3 ugers udtørring. Resultater. Der blev rapporteret ni bivirkninger (7 milde, 1 moderat og 1 alvorlig), hvilket tyder på, at Tv blev godt tolereret. Immunologiske resultater viste tendenser til (1) øget antal lymfocytter ved 6 og 9 gram/dag; (2) øget funktionel aktivitet af naturlige dræberceller ved 6 gram/dag; (3) dosisrelaterede stigninger i CD8+ T-celler og CD19+ B-celler , men ikke CD4+ T-celler eller CD16+56+ NK-celler. Konklusion. Disse resultater viser, at op til 9 g/dag af et Tv-præparat er sikkert og tolerabelt hos kvinder med brystkræft efter primær behandling. Dette Tv-præparat kan forbedre immunstatus hos immunkompromitterede brystkræftpatienter efter standard primær onkologisk behandling.

1. Indledning

Trametes versicolor (Tv), også kendt som Coriolus versicolor og almindeligvis kaldet kalkunhale, er en svampeart, hvoraf der er fremstillet præparater, som har en lang historie med anvendelse i traditionel asiatisk medicin . To proteoglykanfraktioner, polysaccharid-K (PSK) og polysaccharid-peptid (PSP), er lignende varmtvandsekstrakter af Tv med rapporteret kræftbekæmpende aktivitet . I Japan ordineres PSK rutinemæssigt til kræftpatienter, både under og efter stråle- og kemoterapi . Det er også en almindelig praksis blandt mange naturopatiske læger (ND’er) og integrative onkologer (MD’er) i USA at ordinere hele, frysetørrede Tv til brystkræftpatienter . Tv’s immunologiske aktivitet antages at være den vigtigste underliggende mekanisme, der er ansvarlig for dets antitumorvirkninger samt dets indvirkning på overlevelsesraten . Trametes versicolor’s virkningsmekanisme indebærer en forbedring af både medfødte og adaptive immunresponser, i det mindste delvist via Toll-like 2 receptor agonist aktivitet . Prækliniske dyreforsøg og foreløbige kliniske data understøtter hypotesen om, at Tv-derivater kan være gavnlige i behandlingen af både østrogenreceptor-negative og positive kræftformer ved at afbøde immunologiske depressive virkninger af behandlingen og øge den sygdomsfri overlevelse via forbedring af immunologisk overvågning og overvindelse af tumorantigen-tolerance .

Forståelse af, hvordan immunologiske faktorer påvirkes af behandlinger af brystkræft, tyder på lovende fokusområder i udviklingen af supplerende behandlinger til styrkelse af antitumor-immunresponser. Nylige data viser, at visse klasser af kemoterapeutiske lægemidler forårsager immunogen tumorcelledød, hvilket fører til en forbedring af antigencrosspræsentation og stimulering af antitumor-immunresponset. Der er tegn på, at NK-celler spiller en vigtig rolle i forebyggelsen af både tidlig og metastatisk brystkræft . Det er blevet rapporteret, at nogle brystkræftpatienter mangler NK-celleaktivitet mod K562-målceller . De nuværende data tyder på, at brystkræftpatienter, der har afsluttet operation, kemoterapi og strålebehandling, har immunologisk underskud . Andersen et al. har rapporteret, at stressniveauet hos brystkræftpatienter signifikant forudsagde lavere NK-cellelysis samt nedsat proliferativt respons på perifere blodlymfocytter . Vores tidligere observationsundersøgelse bekræftede, at lymfopeni og lav NK-celleaktivitet var til stede i hele 6 uger efter afslutningen af strålebehandling .

For bedre at forstå den potentielle fordel ved Trametes versicolor hos kvinder med brystkræft var der behov for en dosiseskaleringsundersøgelse for at evaluere sikkerhed og tolerabilitet. Med henblik herpå gennemførte et tværfagligt team fra University of Minnesota og Bastyr University et fase 1-dosiseskaleringsforsøg for at bestemme sikkerheden og den maksimalt tolererede dosis af Tv hos kvinder diagnosticeret med brystkræft, som gennemgik standardbehandling for brystkræft og var villige til at deltage i en ni ugers undersøgelse efter strålebehandling.

2. Metoder

2.1. Undersøgelsens dosiseskalering

Der blev anvendt et standard fase 1-design med 3 forsøgspersoner pr. dosisniveau, indtil MTD (maksimalt tolereret dosis) er nået. Dosiseskaleringsskemaet for hver kohorte af Tv var en 3 gm (den mest almindeligt anvendte dosis); 6 gm; 6 gm; 9 gm; 12 gm; 18 gm; 24 gm. Denne undersøgelse rekrutterede kun gennem kohorten på ni gram (𝑁=9).

2.2. Undersøgelsesdeltagere

Kvinder mellem 21 og 75 år, der var diagnosticeret med brystkræft i stadie I, II eller III, og som havde gennemgået operation og kemoterapi og var klar til at påbegynde strålebehandling, blev indskrevet i undersøgelsen efter at have givet skriftligt samtykke. Kvalificeringen omfattede også villighed til at spise en konsekvent kost under hele undersøgelsen og undgå kostkilder af svampe og andre urteprodukter med rapporterede immunmodulerende virkninger under strålebehandling og indtil undersøgelsens afslutning. Hæmatologiske, nyre- og leverfunktioner inden for normale grænser skulle være inden for normale grænser før indskrivning i undersøgelsen. Undersøgelsen blev gennemført på Cancer Center at the University of Minnesota i Minneapolis, Minnesota, og Bastyr University i Ken more, Washington. Undersøgelsen blev godkendt af IRB-komitéerne på University of Minnesota og Bastyr University. Mellem januar 2008 og juni 2010 opfyldte 11 kvinder med brystkræft i stadie I-III de snævre kriterier for dette forsøg, gav deres samtykke til at deltage og blev indskrevet sekventielt fra kohorten med den laveste dosis. Tre deltagere i hver af kohorterne på 3 gm, 6 gm og 9 gm gennemførte undersøgelsen. To af deltagerne trak sig ud af undersøgelsen efter besøg nummer to på grund af problemer med transport til klinikken. Karakteristika for de ni kvinder, der gennemførte undersøgelsen, omfattede et aldersspænd fra 38 til 68 år; seks ER-negative og tre ER-positive; tre stadie I; to stadie II og fire stadie III brystkræftformer. En af de kvinder, der gennemførte undersøgelsen, gennemgik ikke kemoterapi før strålebehandling, og en overtrædelse af protokollen for støtteberettigelse blev rapporteret til IRB.

2.3. Resultatmålinger

Det primære mål med undersøgelsen var at evaluere sikkerheden og tolerabiliteten af Trametes versicolor hos kvinder med brystkræft efter strålebehandling. De ni deltagere i dosiseskaleringsundersøgelsen blev overvåget for uønskede hændelser (AE) ved hjælp af både kliniske og laboratoriemetoder og kriterier for dosisbegrænsende toksicitet (DLT) defineret som enhver behandlingsrelateret toksicitet af grad 2 eller højere som scoret ved hjælp af NCI’s Common Terminology Criteria for Adverse Events V 3.0 (CTCAE). Kvinderne blev screenet ugentligt for bivirkninger under produktadministration enten ved deres klinikbesøg eller ved telefonisk screening mellem besøgene. Det sekundære mål var at indsamle foreløbige data, der sammenlignede baseline før og efter strålebehandling, immunologiske målinger under og efter behandlingen, herunder komplet blodtælling med differentialdiagnoser, NK-celleaktivitet (natural killer), T-regulerende celleassay, T/B/NK-celleundergruppeassay, fagocytisk indeks og cytokinniveauer. Statistisk analyse, herunder t-tests af uafhængige prøver og envejs ANOVA’er med Tyrkiet post hoc multiple sammenligning, blev udført ved hjælp af GraphPad Prism, version 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). For at øge effekt og stikprøvestørrelse blev data fra en observationsundersøgelse (𝑁=14), der blev udført af vores centre siden 2006, kombineret med den aktuelle dosiseskaleringsundersøgelse (𝑁=9). Støtteberettigelseskriterierne var identiske for begge undersøgelser (𝑁=23).

2.4. Svampemedicinprodukt

Trametes versicolor frysetørret mycelialpulver blev indhentet fra Paul Stamets hos Fungi Perfecti, Inc. i Olympia, WA og blev indkapslet af Beehive Botanicals (Hayward, WI). Hver kapsel indeholdt 500 mg af produktet. FDA IND-godkendelse (nr. 75.405) blev opnået i 2007.

2.5. Immunforsvar

2.5.5.1. Komplet blodtælling med differentialdiagnostik

De kliniske laboratorieprøver (CBC, kemi, serumgraviditetstest og urinanalyse) blev udført på Department of Laboratory Medicine på University of Washington for deltagere rekrutteret på Bastyr University-området og på University of Minnesota Fairview Diagnostic Laboratory for deltagere rekrutteret på U of Minnesota-området.

2.5.2. Natural Killer Cell Functional Activity

Den delmængde af immunceller, der blev målt, omfattede NK-celleaktivitet, T-regulatorisk celleassay, T/B/NK-celle delmængdeassay, fagocytisk indeks og cytokinniveauer. Immunologiske analyser blev udført i laboratoriet på Bastyr University for forsøgspersoner, der blev rekrutteret fra begge steder. Blod, der blev indsamlet på University of Minnesota General Clinical Research Center (GCRC), blev sendt natten over til Bastyr University. Kvaliteten af det transporterede blod fra University of Minnesota til Bastyr blev vurderet ud fra følgende kriterier. For prøver, der var ældre end 48 timer, da de ankom til Bastyr-laboratoriet, blev lymfocytterne isoleret, og cellernes levedygtighed blev bestemt ved trypanblå farvning. Hvis levedygtigheden var større end 80 %, blev analysen udført. Hvis levedygtigheden var mindre end 80 %, blev prøverne afvist. Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev isoleret ved hjælp af Ficoll-Hypaque-gradient (densitet = 1,070 g/mL), vasket to gange i PBS og opbevaret i RPMI 1640, 10 % FBS med 2 mM L-Gln og penicillin-streptomycin (1000 U/mL; 1 mg/mL). NK-celleaktiviteten af disse PBMC-prøver, målt ved evnen til at dræbe K562-tumormålceller, blev vurderet i tre eksemplarer med effektor-til-mål-forholdet (E : T) på 50 : 1, 25 : 1 og 12,5 : 1 efter offentliggjorte metoder . Målcellerne blev mærket med 3,3′-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiOC18) og samkultiveret med PBMC-effektorceller i fire timer. Der blev medtaget en kontrolprøve med kun K562-celler for at bestemme den spontane målcelledød. Efter inkubationen blev der tilsat propidiumjodid for at påvise døde celler. Procentdelen af dræbte målceller blev bestemt ved at trække procentdelen af spontane lyser fra den procentvise specifikke lysis (PSL) af de respektive E : T-forholdet. For at repræsentere standardiseret NK-celleaktivitet blev lytiske enheder beregnet af et tidligere offentliggjort og valideret softwareprogram ved hjælp af følgende parametre: mål pr. brønd = 10 000; LU pr. nr. celle = 107; kurvemaksimum = 48; procent lyser = 20 . LU20-værdier, defineret som E : T-forholdet, hvor 20 % af målcelledøden sker, blev ekstrapoleret fra dosis-respons-kurver for PSL over for log E : T-forholdet for hver blodprøve, der er undersøgt .

2.5.3. Immunofænotyping PBMC-subsæt

PBMC-suspensioner (5×105 celler) blev anbragt i 3 rør, vasket i PBS, centrifugeret, supernatanterne blev piratkopieret, og cellepellets blev resuspenderet i 100 μL PBS. PBMC’er i rør 1 blev farvet med CD3-PC5, CD4-PE og CD8-FITC; rør 2: CD3-PC5, CD16-FITC og CD56-PE; rør 3: CD14-PC5. Rørene blev vortexet kortvarigt, dækket til og inkuberet på is i 15 minutter, hvorefter cellerne blev vasket i kold PBS to gange, resuspenderet til 0,5 mL i PBS og procent PBMC-undergrupper bestemt ved flowcytometrisk analyse ved hjælp af en Beckman Coulter FC500 og CXP-software.

2.6. Klinisk forsøgsprotokol

Undersøgelsens varighed var ni uger og startede efter afslutning af strålebehandling. Den omfattede seks ugers brug af produktet efterfulgt af en tre ugers vaskeperiode uden brug af produktet (figur 1). Patienterne blev screenet og fundet egnet til undersøgelsen efter afslutning af kemoterapi og før påbegyndelse af strålebehandling. Undersøgelsen krævede seks besøg på de kliniske forskningscentre. Det første studiebesøg fandt sted før påbegyndelse af strålebehandling, hvor der blev taget baselineprøver. Inden for den første uge efter afslutningen af strålebehandlingen havde deltagerne deres andet besøg, hvor der blev taget laboratorieprøver, og undersøgelsen på ni uger blev indledt. Deltageren fik seks uger med Tv-produktet og vendte tilbage til forskningscentret til besøg tre, fire og fem med to ugers mellemrum til laboratorieudtagning og vurdering af produktets tolerabilitet og bivirkninger. Det sidste (sjette) besøg var efter ni uger, efter tre uger uden produkt, for en sidste laboratorieudtagning og vurdering af eventuelle langvarige bivirkninger.

3. Resultater

3.1. Bivirkninger

Resultaterne fra denne dosiseskaleringsundersøgelse viste, at op til 9 gram/dag af Tv-præparatet blev godt tolereret hos kvinder med brystkræft i seks uger i forbindelse med behandling efter strålebehandling. Der var ni bivirkninger; syv milde, én moderat og kun én grad 3-bivirkning, som var et angstanfald hos en deltager, der sandsynligvis ikke havde noget med studiemedicinen at gøre (tabel 2). Andre rapporterede milde bivirkninger omfattede forbigående hjerteforbrænding, hjertebanken, forstoppelse, brystsmerter, feber, strålingsdermatitis og forkølelse/ influenza-symptomer. Alle tre doser blev godt tolereret, og deltagerne havde ikke problemer med at sluge op til 9 kapsler tre gange dagligt. Det er bemærkelsesværdigt, at der hverken blev rapporteret kvalme eller GI-forstyrrelser; to bivirkninger blev rapporteret i tidligere kliniske forsøg med andre Tv-ekstrakter.

3.2. Immunrespons

Det røde blodcellekompartment var upåvirket af både strålebehandling (RT) og Tv-administration. Absolut antal røde blodlegemer, hæmoglobin og hæmatokrit var normale ved besøg 1, som var dagen før RT begyndte, og fortsatte med at ligge inden for de normale grænser i resten af undersøgelsen. Det absolutte antal hvide blodlegemer og antallet af neutrofiler var generelt inden for normalgrænserne for alle kvinder både før og efter RT og i ugerne efter RT, mens de fik Tv (data ikke vist). Det absolutte lymfocyttal viste imidlertid et andet mønster end de andre CBC-undergrupper. Da udvælgelseskriterierne var identiske i undersøgelser udført af vores centre siden 2006, kombinerede vi for at øge effekten data fra vores observationsundersøgelse (𝑁=14), der viste, at RT producerede immundefekter hos kvinder med brystkræft i stadie I-III, med vores nuværende dosiseskaleringsundersøgelse (𝑁=9) for at øge effekten. For det kombinerede antal på 23 kvinder i begge undersøgelser med stadium I-III brystkræftstatus efter brystkirurgi og kemoterapi, som derefter modtog strålebehandling, var lymfocytterne inden for de normale grænser før RT, men faldt til unormalt lave niveauer efter RT. Det gennemsnitlige lymfocyttal for alle 23 forsøgspersoner før RT var 1,027 ± 0,298 og faldt med 20% efter RT til 0,681 ± 0,254, en forskel, som var statistisk signifikant . I dosiseskaleringsundersøgelsen resulterede de to højere orale doser (6 og 9 g) af Tv i en tidligere genopretning af lymfocyttallene (figur 2). Antallet af lymfocytter blev gradvist genoprettet for observationsgruppen, men det gennemsnitlige lymfocyttal forblev under det for 6 og 9 g Tv-kohorterne 6 uger efter RT. På grund af det lille antal for hver dosiskohorte (𝑁=3) blev der kun fundet statistisk signifikans mellem observations- og 9 g-grupperne på tidspunktet 2 uger efter strålebehandling. Strålebehandling nedsatte statistisk signifikant det absolutte antal lymfocytter hos kvinder med brystkræft i stadie I-III, som har afsluttet operation og kemoterapi (se figur 2).

Den funktionelle aktivitet af naturlige dræberceller blev dramatisk reduceret fra før til post-RT for alle 23 brystkræftpatienter, der gennemførte de to første besøg i enten observationsstudiet (𝑁=14) eller dosiseskaleringsstudiet (𝑁=9). Figur 3 viser, at den gennemsnitlige NK-celleaktivitet var 19,941±18,959 før RT og faldt til 9,872±13,454 efter RT (𝑁=23). Dette fald var statistisk signifikant (𝑡(44)=2,077, 𝑃=0,043). Der blev observeret en tendens til øget NK-celleaktivitet i kohorten med 6 g Tv-dosis.

Strålebehandling nedsatte statistisk signifikant NK-cellefunktionen repræsenteret ved LU, som er beregnet ved 107 dividerede doser med LU20. LU20 er det antal effektorceller (NK), der er nødvendigt for at opnå 20 % specifikke lyser på målcellerne (K562). Derfor er NK-cellerne mere effektive, jo mindre LU20 er, jo mere effektive er NK-cellerne. Fortolkningen af dette resultat kan have været vanskelig på grund af forskellige reaktioner hos enkeltpersoner efter tilskud af svampe. Tendensen til midlertidig stigning i NK-celleaktivitet blev observeret i dosisgruppen på 6 g (se figur 3).

Vi målte også virkningerne af strålebehandling og Tv-administration på T-, B- og NK-cellepopulationer hos de ni patienter, der gennemførte fase I-dosiseskaleringsundersøgelsen. Ud fra WBC- og flowcytometri-immunofænotypedataene blev den absolutte værdi (mm3) beregnet. Strålebehandling havde en ubetydelig virkning på CD4+ og CD8+ T-celler, CD19+ B-celler og CD16+/56+ NK-cellepopulationer. Da der ikke blev foretaget immunofænotyping i observationsundersøgelsen, var antallet af sammensatte scoringer (før og efter bestråling) af dem, der deltog i dosiseskaleringsundersøgelsen (𝑁=9). Antallet af CD8+ T-celler var ikke statistisk forskelligt før og efter strålebehandlingen (figur 4). Der blev imidlertid observeret stigninger i CD8+ T-celler og CD19+ B-celler i perifert blod for Tv-suppleringsgrupperne. Antallet af CD8+ T-celler i løbet af den 9 ugers dosiseskaleringsundersøgelse var øget i kohorten med 9 gm Tv-dosis sammenlignet med både 3 g- eller 6 g-gruppen. Envejs ANOVA blev anvendt til at analysere den samlede forskel mellem doseringsgrupperne i løbet af behandlingsperioden (2-4-6 uger). Den viste den statistisk signifikante stigning i de CD8+ cytotoksiske T-celler for 9 g-gruppen sammenlignet med både 3 g- og 6 g-gruppen (𝐹(2,6)=42,04, 𝑃=0,0003). Forskellen mellem 3 g- og 6 g-gruppen var ikke signifikant (se figur 4).

I henhold til de sammensatte resultater for otte deltagere med dosiseskalering ændrede strålebehandling ikke B-celleantallet signifikant (figur 5). Tv-administration var dog forbundet med en stigning i CD19+ B-celler. Envejs ANOVA blev anvendt til at analysere den samlede forskel mellem doseringsgrupperne i løbet af behandlingsperioden (2-4-6 uger). Det viste den statistisk signifikante stigning i CD19+ B-celler for dosisgruppen på 6 g sammenlignet med gruppen på 3 g . Forskellen mellem 3 g- og 9 g-grupperne og også mellem 6 g- og 9 g-grupperne var ikke signifikant (se figur 5).

Med hensyn til antallet af CD16+56+ NK-celler blev der ikke observeret nogen signifikante ændringer som følge af hverken strålebehandling eller Tv-administration (Figur 6). Da NK-celleaktiviteten både blev nedsat af RT og øget i kohorten med 6 gram Tv-dosis (Figur 3), men NK-cellepopulationerne syntes ikke at være signifikant påvirket af disse behandlinger, tyder dataene på, at en forøgelse af NK-celleaktiviteten ikke skyldes behandlingsinducerede ændringer i antallet af NK-celler. NK-cellepopulationen blev ikke påvirket af hverken strålebehandling eller af orale doser af Tv (se figur 6).