Resultater og diskussion
Vi begyndte med at teste Taq (fra Thermus aquaticus), High-fidelity Vent (exo-, fra Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, fra Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, fra Pyrococcus sp. GB-D) og Q5 (exo+) DNA-polymeraser i traditionelle polymerasekædereaktioner (PCR) med et deoxyribonukleosidmonofosfat (dGMP), dNDPs og dNTPs som substrater (fig. 1 A og B). Udskiftning af nogen af dNTP’erne til dNDP’er understøttede robust DNA-syntese, og yderligere eksperimenter med to, tre eller alle fire dNDP’er i stedet for dNTP’er understøttede PCR. For at sikre, at produkterne ikke skyldtes forurenende dNTP’er, og at reaktionerne ikke blev forstærket af stabilisatorer i kommercielle buffere eller enzymlagre, testede vi DNA-syntese fra rensede dNDP’er ved hjælp af hjemmelavede buffere og enzymer. Vi inkluderede også bakterielle replikative enzymer, såsom de bakterielle replikative DNA-polymeraser fra den termofile Bacillus stearothermophilus (Bst) og den mesofile Bacillus subtilis (Bsu, stort fragment). Disse viste sammen med arkæologiske polymeraser fra Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) og Thermococcus gorganarius (Tgo) robuste primerforlængelser ved brug af blot 100 µM oprenset dNDPs ved 60 °C (undtagen Bsu, som blev testet ved 37 °C i alle tilfælde) (Fig. 1C). Primerforlængelsesreaktionerne var effektive for alle disse enzymer, især for Deep Vent, KOD og 9°N. Der blev observeret pausering før inkorporering af dA og dC i det nascent oligonukleotid (Fig. 1 C og D), hvilket tyder på, at KM’erne for dADP og dCDP er høje nok til at bremse primerforlængelsen ved en substratkoncentration på 100 µM.
For at få en mekanistisk indsigt i reaktionen undersøgte vi først dens effektivitet ved hjælp af Taq-enzymet. Variation af forlængelsestemperaturen fra 50 °C til 72 °C resulterede ikke i nogen observerbar forskel i mængden af fuldlængdeproduktet. For at forenkle de kinetiske analyser blev alle PCR-reaktioner udført ved hjælp af en to-trins temperaturcyklusprotokol, hvor primeren blev annealet og forlænget i første trin ved 72 °C, og duplexen smeltet ved 95 °C i andet trin (Fig. S1A). For at sammenligne hastighederne for dNDP-anvendelse med de kanoniske dNTP’er blev forlængelsestiden varieret fra 15 til 120 s. For en 15-s forlængelsestid producerede dNTP-reaktionen ca. fire gange så meget produkt sammenlignet med reaktionen med en forlængelsestid på 2 minutter, der indeholdt dNDP’erne (Fig. S1B). Disse data tyder på, at inkorporeringshastigheden for diphosphaterne er langsommere end for de traditionelle triphosphater, hvilket ville være forventeligt i betragtning af dNDP’ernes lavere grundstatisenergi. Vi spurgte dernæst, om en enkelt eller alle fire dNDP’er er ansvarlige for den langsommere inkorporeringshastighed. Kvantitativ PCR (qPCR) blev anvendt til en nøjagtig måling af produktdannelsen. Hver diphosphat blev afhørt uafhængigt ved at kombinere den med 0,2 mM af de tre andre dNTP’er for at amplificere en lang DNA-template. Disse reaktioner blev normaliseret i forhold til en kontrolreaktion, som indeholdt 0,2 mM af alle fire dNTP’er (fig. S1C). En værdi på 1 angiver, at et diphosphat inkorporeres lige så effektivt som dets triphosphatanalog. Disse resultater tyder på, at dADP inkorporeres mindst effektivt (1 mM dADP gav ∼60% af 0,2 mM dATP), efterfulgt af deoxythymidin-diphosphat (dTDP) og deoxycytidin-diphosphat (dCDP). På den anden side er det kun nødvendigt med en to gange større koncentration af dGDP for at opnå samme PCR-effektivitet som dGTP-kontrolreaktionen.
For at analysere DNA-polymerisationen direkte udførte vi en primerforlængelsesreaktion af en 32P-mærket primer og en lang (706 nt) skabelon. Diphosphatkoncentrationen blev varieret fra 0,1 til 1,0 mM og kombineret med 0,2 mM af de tre andre dNTP’er, svarende til de qPCR-reaktioner, der er beskrevet ovenfor. Som forventet mindskede stigende koncentrationer af dADP den tid, der var nødvendig for at fremstille fuldlængdeproduktet (fig. 1E). Pausering langs længden af skabelon-DNA’et blev kun observeret i tilfælde af dADP, hvilket tyder på, at polymerasen går i stå under inkorporeringen af dADP-substrater (Fig. 1E). På den anden side antydede den manglende pause i dTDP-reaktionen, at dTDP blev udnyttet mere effektivt end dADP (Fig. S2A), som det blev antydet af qPCR-analysen (Fig. S1A). Analyse af produktdannelse antydede, at dADP-koncentrationen, der kræves for at nå halvmaksimumhastigheden, er ∼420 µM (Fig. S2B), mere end en størrelsesorden over KM for dNTP’er, der tidligere er målt (16 og 24 µM) (5, 6). I nærheden af mættende koncentration af dADP syntetiseres DNA i fuld længde på ca. 30 s, og i betragtning af at 706-nt-sekvensen indeholder 182 adenosiner, er den gennemsnitlige udnyttelseshastighed af dADP mindst ∼6 s-1. Dette er omkring en størrelsesorden langsommere end Taq-polymerasens gennemsnitlige udnyttelseshastighed af dNTP’er (kcat = 47 s-1) og ligger inden for 1,5 gange kcat for Pfu (7).
For yderligere at sammenligne kinetikken af DNA-syntese på lange skabeloner fra dNDP’er og dNTP’er anvendte vi en singe-stranded DNA (ssDNA) M13mp18 plasmidskabelon på 7 249 nt (8). Bsu- (ved 37 °C), Bst- og Taq-polymeraser (ved 60 °C) viste robust DNA-syntese fra dNDPs (Fig. S2C). Vi målte hastigheden af DNA-syntese ved hjælp af fluorescensen af SYTO9-interkalatoren, der blev observeret af en realtids-termisk cycler ved varierende dNDP- og dNTP-koncentrationer (Fig. S2D) (9). Et plot af disse hastigheder i forhold til nukleotidkoncentrationen afslørede en tilsyneladende KM på ∼0,4 mM for dNDPs og en maksimal synteserate, der er ca. 17 gange lavere for dNDPs end for dNTPs (Fig. S2E). Disse resultater viser i en direkte sammenligning under identiske betingelser, at DNA-synteseraten fra dNDPs er lidt over en størrelsesorden lavere end fra dNTPs, og at Vmax/KM således er ca. 400 gange lavere for dNDPs end for dNTPs.
En polymerisationsreaktion med kanoniske triphosphatsubstrater øger længden af den nascent DNA-streng med en nukleotid, hvorved der frigives en PPi (3). Under den omvendte reaktion, pyrofosforolyse, forkortes primeren med et nukleotid, og der frigives en dNTP. Tilsvarende frigøres fosfater af polymeraser, når der anvendes dNDP’er som substrater, og den omvendte reaktion er fosforolyse af DNA (fig. 2A). For at bekræfte, at polymeraserne udnytter dNDPs direkte og ikke bruger en hidtil ukendt enzymatisk aktivitet (eller copurificeret nukleotiddiphosphatkinase), der omdanner to dNDPs til en dNTP og en dNMP, brugte vi oprensede dNDPs og analyserede produkterne af en primer-extensionsreaktion. Vi målte produktionen af fosfat ved hjælp af en fluorescerende sensor, som er afledt af det bakterielle fosfatbindende protein og udviser en høj specificitet for fosfat (10). Vi fandt, at fosfat opbygges i tilstedeværelse af rensede dNDP’er og Taq DNA-polymerase (Fig. 2B), men i eksperimenter uden polymerase sker det ikke i eksperimenter uden polymerase. I kontrolforsøg med dNTP’er blev der observeret fosfatproduktion, men dens hastighed var langsommere og uafhængig af enzymet, hvilket tyder på, at det påviste fosfat skyldtes dNTP-nedbrydning til dNDP og fosfat og ikke var relateret til DNA-syntese. Disse resultater bekræftede, at Taq direkte udnytter dNDP’er som substrater og frigiver fosfat som biprodukt af DNA-syntesen. Da vi målte mængden af fosfat produceret i primerforlængelser på det 7,249-nt M13 ssDNA, der er beskrevet ovenfor, fandt vi, at ∼1-11 µM fosfat blev produceret ved hjælp af en 1,6-nM skabelon over baggrundsfosfatproduktion fra dNDP-nedbrydning (Fig. S3A). Denne fosfatkoncentration svarer til ∼2-6.000 molekyler pr. DNA eller ca. 0,1-0,9 af den skabelon, der er kopieret ved hjælp af dNDPs. Det store interval skyldes en relativt stor fosfatbaggrund i udgangsmaterialet og baggrundsreaktionen, der er subtraheret fra signalet i primerforlængelsesreaktionen.
DNA-fosforolyse med Taq DNA-polymerase. (A) Skema over fremadrettede og omvendte reaktioner med henholdsvis dNTP’er/dNDP’er og pyrofosfat/fosfat som substrater. (B) Fosfatspecifik fluorescerende sensor afslørede fosfat i en Taq-katalyseret primer-extensionsreaktion med rensede dNDPs (gennemgående linje). Der blev ikke observeret nogen fluorescens, når enzymet blev udeladt (stiplet linje). (C) Uorganisk fosfat (Pi)- og pyrofosfat (PPi)-afhængige omvendte reaktioner over 20 min viser fordøjelsen af den 5′-mærkede primer. (D) TLC-analyse med anionbytning af produkter, der frigives under den omvendte reaktion. Inkubation af Taq-polymerase i nærvær af fosfat (Pi) og en 32P-mærket primer giver 32P-dADP, og tilsætning af 5 mM pyrofosfat til reaktionen giver også 32P-dATP, hvilket giver yderligere bevis for, at Taq DNA-polymerase kan udnytte både di- og trifosfat-substrater til polymerisation. (E) DNA-nedbrydning med fosfat (○) og pyrofosfat (●), der viser store forskelle i KM (∼10 og 0,054 ± 0,005 mM) og Vmax (henholdsvis 0,0010 ± 0,0005 og 0,205 ± 0,005 s-1). Pyrofosfatdataene blev tilpasset direkte (indsat i lineær skala), mens parametrene for fosfat blev ekstraheret fra et dobbelt-reciprok plot af dataene.
For at verificere, at reaktionerne ikke producerer dNTP’er fra dNDP’er, inkuberede vi Taq-polymerasen med 250 µM af dCDP og dTDP og opløste reaktionerne ved ionbytningskromatografi (Fig. S3B). Denne analyse afslørede ingen nye molekylære arter svarende til mono- eller triphosphorylerede nukleotider i den enzymholdige reaktion sammenlignet med den enzymfrie reaktion, hvilket indikerer en mangel på fosforyltransferaseaktivitet i enzympræparatet og yderligere støtter direkte udnyttelse af dNDPs i DNA-syntese.
Som beskrevet ovenfor frigiver reaktioner med dNDP-substrater et uorganisk fosfat (Pi), og den omvendte reaktion er således fosforolyse af DNA (Fig. 2A). For at teste effektiviteten af denne omvendte reaktion undersøgte vi fosforolysen af en 5′ 32P-mærket primer annealeret til en skabelonstreng ved at inkubere den med enzymet og 10 mM Pi. Fig. 2C viser fjernelsen af det terminale 3′-nukleotid fra primerstrengen af Taq DNA-polymerase i tilstedeværelse af Pi og PPi, hvilket viser, at Taq DNA-polymerase kan gennemgå den omvendte reaktion af DNA-polymerisation fra både dNTP’er og dNDP’er. Analyse af de termofile Bst-, Deep Vent-, KOD- (Fig. S4A), 9°N-, Tgo og de mesofile Bsu-polymeraser viste også fosforolyse af DNA (Fig. S4B), om end i mindre omfang. En kontrolreaktion med Klenow-fragmentet af Escherichia coli DNA-polymerase I, som ikke accepterer dNDPs som substrater, blev også undersøgt (Fig. S4C) og viste, at tilstedeværelsen af PPi, men ikke Pi, resulterer i en forkortelse af primeren.
For yderligere at analysere den omvendte reaktion fremstillede vi dsDNA, der var internt mærket med 32P-fosfat, ved at udføre en primerforlængelsesreaktion med α-32P-dATP, efterfulgt af PAGE-oprensning. Vi analyserede produkterne af den omvendte reaktion ved hjælp af anionudveksling (polyethylenimin) TLC. Som forventet gav inkubation af det internt mærkede DNA med Taq-polymerase og pyrofosfat produkter, der komigrerede med dATP. Reaktioner i tilstedeværelse af fosfat gav hurtigere migrerende arter, svarende til dADP, og reaktioner uden fosfat eller pyrofosfat gav ingen migrerende arter, hvilket indikerer, at i tilstedeværelse af Taq-polymerase alene forblev DNA’et intakt (fig. 2D) og bekræfter, at den omvendte reaktion er fosforolyse af DNA.
Endeligt afslørede analyse af den substratafhængige kinetik af den omvendte reaktion en KM på ∼10 ± 5 mM (n = 9) og 57 ± 5 µM (n = 5) for henholdsvis fosfat og pyrofosfat, selv om lav opløselighed af magnesiumfosfat over 10 mM udelukkede os fra at opnå præcise målinger (Fig. 2E). Krystalstrukturer af DNA-polymeraser med pyrofosfat eller phosphonoforminsyre i de aktive steder viser en coulombisk interaktion med proteinet (11⇓-13). Det 200-dobbelte forhold mellem KM’erne for de to substrater svarer til ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) ved 72 °C, en bindingsenergi, der omtrent svarer til en ionisk vekselvirkning mellem det ekstra fosfat og et kompenserende kation på proteinet og støtter en model, hvor fosfat/pyrofosfat hovedsageligt genkendes gennem en ladningsladningsinteraktion. Estimater af de maksimale hastigheder for den omvendte reaktion fulgte en lignende tendens: under disse betingelser var Vmax 0,0010 ± 0,0005 s-1 og 0,205 ± 0,005 s-1 for henholdsvis fosfat og pyrofosfat, hvilket igen afslørede et ca. 200-dobbelt forhold mellem de to aktiviteter. Samlet set er fosfatreaktionen under mættende koncentrationer af de to substrater ca. 4 × 104 gange mindre effektiv, hvilket tyder på, at fosforolyse af DNA ikke udgør en væsentlig trussel mod genomets stabilitet.
For at få yderligere indsigt i DNA-syntese fra de lav-energiske substrater (dNDPs og Pi) målte vi aktiveringsenergierne ved hjælp af Arrhenius-analysen af fremad- og omvendte reaktioner. Da enkeltmolekylmålinger af konformationsændringer i forbindelse med genkendelse og inkorporering af de korrekte dNTP’er afslørede hurtigere proteinbevægelse end den observerede reaktionskinetik (14), er det hastighedsbegrænsende trin i fremadreaktionen i Taq-polymerasen sandsynligvis relateret til kemitrinet eller en prækatalytisk aktivitetsstedsomlægning, der afhænger af interaktionen med substratfosfaterne. Vi observerede, at Vmax for både fremadrettede og omvendte reaktioner er lavere for dNDP og fosfat end for dNTP og pyrofosfat, hvilket tyder på, at det hastighedsbegrænsende trin er følsomt over for substraternes fosforyleringstilstand. Både den prækatalytiske omlægning (som f.eks. tilpasning af rester på det aktive sted og binding af en katalytisk Mg2+-ion) og det kemiske trin kan imidlertid påvirkes af substratfosforyleringen; derfor kan begge trin være hastighedsbegrænsende i tilstedeværelse af dNDP’er, forudsat at de ikke introducerer et nyt langsomt konformationstrin i mekanismen. I Pol β er disse to trin tidligere blevet foreslået at have lignende hastighedskonstanter (15), og de beregnede aktiveringsenergier for de fremadrettede og omvendte reaktioner, der udnytter de højenergiske substrater (dNTP’er og pyrofosfat), adskiller sig med så lidt som 15 kJ/mol (4). For de termofile Taq- og Klentaq1-enzymer varierer aktiveringsenergien for fremadreaktionen meget, fra 90 til 125 kJ/mol, afhængigt af de eksperimentelle betingelser og sandsynligvis identiteten af de reagerende nukleotider (8, 16), hvorimod aktiveringsenergien for pyrofosforolyse så vidt vides ikke er blevet bestemt eksperimentelt.
Vi analyserede enkelt-nucleotidinkorporeringshastighederne for 50 µM dCDP, dADP og dTDP, der stables på henholdsvis dA, dC og dA, under primerudvidelsesreaktionen. Arrhenius-analysen viste en lineær afhængighed af ln(kobs) af 1/T for eksperimenter under 60 °C og afslørede aktiveringsenergier på 85 ± 14, 108 ± 11 og 112 ± 15 kJ/mol for de tre nukleotider (Fig. 3 A og B; n = 6 for hvert nukleotid). Arrhenius-analyse af den omvendte reaktion med 0,4 mM fosfat, der giver et molekyle dADP, afslørede en stor aktiveringsenergi på 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), hvilket er i overensstemmelse med den observerede langsomme hastighed af DNA-fosforolyse ved Taq (Fig. 3 A og B) og repræsenterer en betydelig stigning i forhold til den beregnede aktiveringsenergi for pyrofosforolyse (92 kJ/mol i Pol β) (4). Aktiveringsenergien for fremadrettede og omvendte reaktioner for dADP adskiller sig således med ∼30 kJ/mol, hvilket giver en stærk bias for DNA-syntese. Denne bias for den fremadrettede reaktion resulterer i et lavere krav til sekestrering af fosfatproduktet ved en nedstrøms metabolisk vej, i modsætning til den dNTP-baserede DNA-syntese og pyrofosfathydrolyse ved uorganiske pyrofosfataser. Hvis de prækatalytiske konformationsændringer i Taq-polymerasen desuden ikke påvirkes af de lavenergiske substrater, og hvis kemitrinnet er hastighedsbegrænsende, kan udnyttelsen af dNDPs og fosfater give ny eksperimentel indsigt i den enzymatiske katalyse af DNA-syntese.
Kinetiske parametre for fremadrettede og omvendte reaktioner med Taq DNA-polymerase. (A) Arrhenius-analyse af fosforolysen (for at fremstille dADP; ▲) og fremadreaktionen med dNDPs, hvilket giver Ea på henholdsvis 138 ± 10 og 90 ± 10 kJ/mol (108 ± 11, 85 ± 14 og 112 ± 15 kJ/mol for henholdsvis dADP, △; dCDP, ○; og dTDP, +). (B) Reaktionskoordinat for de fremadrettede og omvendte reaktioner, vist i forhold til energien for en uudvidet primer, dAMP (antaget at være den samme som AMP-værdien) og fosfat (Pi). Ved at lægge de målte aktiveringsenergier til energien af hydrolyse af ADP og en fosfodiester viser det sig, at overgangstilstanden (TS) er på omtrent samme niveau for fremad- og omvendte reaktioner (inden for eksperimentel fejl, angivet med den grå boks). Den store forskel i aktiveringsenergier og KM’er for dNDPs og fosfat forklarer sammen med den samlede reaktions exergoniske natur effektiviteten af DNA-syntese fra dNDPs, især af de termofile DNA-polymeraser, og den tilsyneladende stabilitet af DNA med hensyn til fosforolyse under enten lav- eller højenergiladning af cellen.
Vores undersøgelse viser, at Taq og flere andre enzymer fra både A- og B-familien af DNA-polymeraser, herunder replikative enzymer fra både termofile og mesofile bakterier, kan erstatte de kanoniske triphosphatsubstrater med diphosphat-analoger. Tidlige beviser for, at γ-fosfatet i nukleotid-substratet kan bruges, fremkom ved undersøgelser af HIV-1 reverse transkriptase og bakteriofagen RB69 DNA-polymerase gp43. HIV-1 RT-varianter, der ophæver den elektrostatiske interaktion mellem γ-fosfatet i den indkommende dNTP og polymerasen, resulterede i bevarelse af aktiviteten, om end med en meget langsommere hastighed (17⇓-19), og bakteriofagen RB69 DNA-polymerase gp43 udviste en lignende aktivitet (20). Begge disse virale enzymer accepterer dNDPs som substrater, men med KM (eller KD), der er 500 og 17 gange højere, og hastighedskonstanter, der er 100 og 400 gange lavere end for dNTPs af hiv-1 RT og RB69 gp43, henholdsvis (20, 21). Vores undersøgelse viser, at cellulære replikative polymeraser besidder denne aktivitet, beskriver substrataffiniteterne og aktiveringsenergierne for både fremadgående og omvendte reaktioner og antyder, at DNA-syntese fra dNDPs er rimeligt effektiv, især for de termostabile enzymer.
Vores resultater tyder på, at DNA-replikation kan udføres ved hjælp af dNDPs som substrater. I termofile kan genomreplikation være mindre følsom over for cellens energiladning end i mesofile, fordi termostable polymeraser kan acceptere de diphosphorylerede såvel som de triphosphorylerede substrater. DNA-replikation er således mindre påvirket af det intracellulære ATP/ADP-forhold, og den relativt høje effektivitet, hvormed DNA syntetiseres ved forhøjede temperaturer, tyder på, at termofile kan være i stand til helt at undvære de triphosphorylerede substrater. Desuden tyder palæobiologiske beviser på, at den sidste fælles forfader til vores biosfære var en termofil (22⇓-24), og vores undersøgelse antyder, at de disfosforylerede substrater kan have været tilstrækkelige til genomreplikation af tidlige organismer, hvilket mindskede behovet for metabolisme af højenergitrifosforylerede metaboliske intermediater. I så fald kunne difosfaterne betragtes som mellemprodukter i udviklingen af de højenergimetabolitter og kan omfatte forfædres byggesten i tidlige genomer, såsom ribonukleotider eller enklere nukleinsyrer.
DNA-polymerase spiller en fremtrædende rolle i mange bioteknologier. Brugen af diphosphat-substrater, som er rapporteret her, har potentiale til at gøre det praktisk muligt at inkorporere dyre analoger, såsom isotopisk mærkede eller kemisk modificerede nukleotider, hvilket eliminerer behovet for udfordrende triphosphat-synteser. Denne egenskab ved DNA-polymeraser kan også give en metode til detektering af nukleotider, der anvendes i DNA-sekventering med højt gennemløb. To almindelige metoder påviser den PPi-afgangsgruppe, der er forbundet med primerforlængelse, enten ved hjælp af en sekundær kemiluminescensanalyse eller ved at overvåge en ændring i den lokale pH-værdi (25, 26). Anvendelsen af et dNDP-substrat giver Pi og giver dermed en yderligere mulighed for at skelne mellem inkorporerede nukleotider. Denne udvidede vurdering af DNA-polymerasens muligheder antyder også, at en undersøgelse af andre triphosphat-afhængige enzymer kunne afsløre tolerance over for diphosphat-substrater med lavere energi og lettere tilgængelige diphosphat-substrater som evolutionære mellemprodukter.