The cnidosac in Cladobranchia
Comparative anatomy of the cnidosac
Forud for denne undersøgelse er der blevet fremsat talrige antagelser om ensartetheden af cnidosac morfologi blandt cladobranchia, der huser kleptocnider . Især Edmunds giver tegninger, der er bemærkelsesværdigt ensartede på tværs af arter af Fionidae, Favorinidae, Facelinidae og Aeolidiidae, selv om cnidosac-beskrivelser ikke var det primære formål med denne publikation. Alle de arter, der er illustreret i dette værk, har en tydelig indgang, der forbinder fordøjelseskirtlen med cnidosac (selv om der i nogle tilfælde er afbildet en let forlængelse af indgangen, svarende til en kanal) og en tydelig udgang i spidsen af ceras, der forbinder cnidosac med ydersiden. Desuden er alle cnidosacs afbildet med kleptocnider, og den måde, hvorpå muskulaturen er fremstillet, er også meget ensartet. Den mest detaljerede undersøgelse af aeolid cnidosacs er indtil nu skrevet af Kälker og Schmekel , men den beskrev ikke i tilstrækkelig grad den variation, der kan findes i denne struktur på tværs af de ca. 600 arter af aeolider . Desuden begyndte arbejdet med de cnidosac-lignende strukturer hos Hancockia spp. først for nylig .
I denne undersøgelse finder vi, at længden, størrelsen og strukturen af indgangen til cnidosacen varierer mere end forventet baseret på tidligere arbejde, hvilket også gælder for strukturen af udgangen, eller cnidoporen, muskulaturen omkring cnidosacen og kleptocnidernes position og orientering . Det er vigtigt at bemærke, at selv om vi giver en bred taxonprøveudtagning af cnidosac-morfologiske karakterer, var der for mange arter kun ét eksemplar til rådighed til analyse. Som sådan bør observationerne om fravær i visse tilfælde tages med forsigtighed. Vi diskuterer især disse taxa nedenfor.
Det tidligere arbejde viser kun en kort og enkel indgang til cnidosac (dvs. en direkte åbning) , sandsynligvis på grund af udvælgelsen af taxa, der har denne tilstand blot ved en tilfældighed. Vores arbejde tyder på, at dette er den mest almindelige overgang mellem fordøjelseskirtlen og cnidosac. Hancock og Embleton nævner imidlertid tilstedeværelsen af en cilieret kanal hos Aeolidia (= Eolis) papillosa, og Herdman og Clubb noterer tilstedeværelsen af en “lang, buet forbindelseskanal” hos det, der nu er Facelina bostoniensis (= Facelina drummondi). Nogle få taxa besidder en cilieret kanal, herunder Aeolidia papillosa, Cerberilla amboinensis, Cratena peregrina, Pteraeolidia ianthina og Paraflabellina ischitana . Disse taxa er ikke nært beslægtede, og derfor er kanalen ikke homolog blandt de taxa, der har den, hvilket tyder på en funktionel forklaring på dens tilstedeværelse. Vi havde oprindeligt mistanke om, at tilstedeværelsen af denne aflange kanal var relateret til størrelsen af kleptocniderne, da A. papillosa, C. amboinensis og P. ianthina alle afsondrer større kleptocnider (> 20 μm i længden). Dette understøttes dog ikke af C. peregrina og P. ischitana, da disse arter udskiller mindre nematocyster. I disse tilfælde kan den cilierede kanal være et levn fra et forfødt skift i kosten, men den mulige funktionelle betydning af den cilierede kanal forbliver spekulativ.
Sådan er der heller ikke noget konsekvent mønster blandt de taxa, der besidder en proliferationszone i forhold til dem, der ikke gør. Den eneste undtagelse er fraværet af en proliferationszone hos de taxa, der ikke sekventerer nematocyster fra slægten Phyllodesmium. Den eneste art inden for Phyllodesmium, hos hvilken vi identificerede en proliferationszone, er P. jakobsenae, som er den eneste art af Phyllodesmium, der er kendt for at huse kleptocnider. Det er stadig uklart, hvorfor nogle taxa synes at have en proliferationszone, mens andre ikke har en, men vi formoder, at i et lille antal tilfælde har artefakter ved sektionering af nogle prøver ført til ødelæggelse af dette område (sandsynligvis på grund af vanskeligheder med konservering), hvilket fører til membranfragmenter og frit flydende kleptocnider i cnidosacerne hos nogle arter a (f.eks. Cratena peregrina; Fig. 4d). For at løse dette punkt bør flere individer fra disse arter undersøges. Det tilsyneladende fravær af en proliferationszone kan også skyldes forskelle i de undersøgte individers vækststadie eller i cerata, hvis nogle af dem var i regenerationsprocessen, men vi fandt ingen beviser, der eksplicit støtter nogen af disse hypoteser. Endvidere nævner mindst én tidligere undersøgelse tilstedeværelsen af denne region , men den blev ikke diskuteret i detaljer. Denne region er det sted, hvor nematocyster optages af cnidofagerne, inden de vandrer mod den distale ende af cnidosacen. Den præcise udstrækning af proliferationszonen er dog stadig uklar. Hos nogle arter synes den at være begrænset til cnidosac (f.eks. Pteraeolidia ianthina; Fig. 4a), men hos andre arter synes denne zone at strække sig ind i de tilstødende dele af fordøjelseskirtlen (f.eks. Dondice occidentalis; Fig. 4b). Hos størstedelen af de taxa, der aflejrer nematocyster, fandt vi kun meget enkle udgange fra cnidosac, som i nogle tilfælde er dækket af et tyndt epitel. Denne belægning indeholder celler, der ligner cellerne i ceratas epidermis, som består af aflange søjleformede celler med, hvad der ser ud til at være mange specialiserede vacuoler. Simple udgange er de mest almindelige, både i vores undersøgelse og tilsyneladende i andre . Hos nogle få udvalgte taxa inden for Aeolidiidae, herunder Aeolidia papillosa, Anteaeolidiella chromosoma og Cerberilla amboinensis, er der dog en kompleks cnidopore til stede (Fig. 4c). Den er forsynet med en epithelial foring, der ser ud til at være kontinuerlig med epidermis. Denne struktur er tidligere blevet identificeret, men blev blot betragtet som en zone med udifferentierede celler, der blev anset for at tjene som en reserve for tabte cnidofager. På grund af placeringen i den distale ende af cnidosacen og som en del af cnidoporen har vi imidlertid mistanke om, at dette ikke er tilfældet. I stedet antager vi, at dette cellelag er en særlig tilpasning til frigivelse af de usædvanligt lange og smalle nematocyster, der er afsondret fra anemoner (op til 50-60 μm i længden, men < 5 μm i bredden). Udtrykket cnidopore er tidligere blevet brugt ukritisk til at henvise til alle udgange fra cnidosac , men vi omdefinerer nu udtrykket cnidopore her for at henvise til den struktur, der hidtil kun er fundet hos Aeolidiidae.
Men selvom muskulaturen omkring cnidosac også varierer på tværs af Aeolidida, er betydningen af denne variation uklar. Muskulaturen omkring cnidosac er meget tynd eller mangler helt hos kun få arter, bl.a. Embletonia gracilis, Embletonia pulchra og Bulbaeolidia alba. Når muskeltykkelsen er til stede, varierer den på tværs af arterne, fra hvad der ser ud til at være et til flere lag. Denne variation i muskulaturens tykkelse er illustreret i en tidligere undersøgelse , dog ikke så præcist som vi angiver her (tabel 3). Der er ingen indlysende evolutionær forklaring på variationen i muskeltykkelse eller antallet af muskellag på tværs af taxa , men et tykkere muskellag ville sandsynligvis resultere i en kraftigere udstødning af kleptocniderne. Øget muskulatur kan være forbundet med prædationspresset, størrelsen af de inkorporerede kleptocnider eller udviklingsstadiet. Inkorporering af yderligere individer fra hver art og på forskellige udviklingsstadier samt målinger af kleptocnidernes størrelse og muskeltykkelse ville være gavnlige for at vurdere disse hypoteser.
Differentieringen af cnidofager fra en funktionel, aktiv celle til en “beholder eller et spisekammer” af kleptocnider ved spidsen af cnidosacen afspejler modningen af kleptocniderne via protontransport, som er umodne og ikke-funktionelle, når de først er afsondret . Efter modning synes cellerne ikke at have nogen yderligere funktion på grund af den reducerede cellekompleksitet. Tidligere arbejdere har forsøgt at behandle oprindelsen af cnidofagens membran , og for nylig har de konkluderet, at det er et fagosom, en specialiseret vesikel dannet af cellemembranen . Inden for cnidofager kan antallet af kleptocnider variere både inden for og mellem taxa. Dette synes at være forbundet med størrelsen af kleptocniderne; der er tendens til at være færre store kleptocnider (> 20 μm i længden) inden for en given cnidofage sammenlignet med dem med mindre kleptocnider (normalt 10 μm eller mindre). Et eksempel kan findes i Pteraeolidia ianthina (Fig. 4a), som afsondrer nematocyster i flere størrelsesklasser.
Afvigelser fra det generelle tema
De morfologiske karakterer, der er vurderet i denne undersøgelse, synes at være ret variable inden for familierne, men de fleste cnidosakker varierer generelt efter et tema, der er bevaret på tværs af Aeolidida. Der er dog stadig andre, der har mistet bestemte cnidosac-strukturer eller har mistet cnidosac’en helt og holdent. Man kan stille den hypotese, at cnidosacerne mister forbindelsen til fordøjelseskirtlen eller muskulaturen omkring cnidosacen, når der ikke er afsondret nematocyster. For eksempel har arter fra slægten Phyllodesmium (bortset fra P. jakobsenae) muskelbundne cnidosacs, der ser ud til at være blottet for kleptocnider, men der er ingen tydelige indgange til fordøjelsesdivertikulumet eller udgange til det ydre miljø. Disse arter oplagrer snarere kemikalier til forsvar og har derfor ikke nødvendigvis brug for en struktureret indgang. På denne måde ligner cnidosakkerne i Phyllodesmium måske de manteldyrsformationer hos Charcotiidae, som mangler en udgang, men frigiver indholdet, når de komprimeres . Hos arter fra slægten Favorinus er cnidosacens overordnede struktur (herunder åbningen fra fordøjelseskirtlen og musklerne omkring cnidosacen) imidlertid den samme, men der er ingen kleptocnider til stede på grund af disse arters tilbøjelighed til at æde æg fra andre sneglearter . Selv om det er muligt, at manglen på kleptocnider kan skyldes en hypotetisk tilbøjelighed hos Phyllodesmium og Favorinus til at afgive nematocyster under fikseringsprocessen, mener vi, at dette er usandsynligt. For det første synes medlemmer af Phyllodesmium at have et intakt epithel, hvor man kunne have forventet, at kleptocniderne ville blive udstødt. Hvis kleptocniderne blev skudt ud under fiksering, ville cererne være fikseret med en åbning i spidsen. Desuden er fraværet af kleptocnider i især Phyllodesmium også veldokumenteret (med undtagelse af P. jakobsenae) . Hos Favorinus er det muligt, at dette er tilfældet, i betragtning af det åbne epithelium i cerataernes spids (f.eks. Fig. 2c), men fraværet af kleptocnider er i overensstemmelse med den vane, at medlemmer af denne slægt spiser snegleæg.
Endnu flere variationer over dette tema findes hos Bulbaeolidia alba, Embletonia spp. og arter inden for slægten Fiona. Bulbaeolidia alba har en sæk i den distale ende af fordøjelseskirtlen, som kun lejlighedsvis indeholder zooxantheller (Symbiodinium). Desuden kunne vi ikke finde nogen tydelig ind- eller udgang til eller fra sækken, og strukturen synes at være omgivet af nogle få tynde muskelfibre. Vi stillede den hypotese, at manglen på kleptocnider kan skyldes den meget lille størrelse af B. alba, som derfor måske har et lavere forsvarskrav, men selv mindre taxa inden for slægterne Embletonia og Pseudovermis har kleptocnider. Alternativt har vi en hypotese om, at en manglende sekventering kan være relateret til størrelsen eller anvendeligheden af de nematocyster, der findes i de anemoner, som denne art lever af . Et tredje alternativ er, at B. alba i stedet huser andre naturlige forbindelser i denne sæk, enten fra byttet som hos Phyllodesmium eller produceret de novo. Igen er det muligt, at manglen på kleptocnider i B. alba er et artefakt af en lille prøve, men ligesom Phyllodesmium kunne der ikke findes beviser for ekstrudering. Medlemmer af Embletoniidae synes evolutionært set at have mistet muskulaturen omkring cnidosac helt eller repræsenterer et mellemtrin i udviklingen af cnidosac, som det diskuteres i afsnittet om cnidosac-evolution nedenfor. Der er heller ikke nogen tydelig indgang eller udgang til og fra cnidosac hos disse taxa. Endelig har nogle arter af Fionidae inden for slægten Fiona (denne undersøgelse) helt mistet cnidosacerne, angiveligt fordi arterne i denne slægt foretrækker ikke-nidariske byttedyr .
Sikrede nematocyster er også blevet fundet i en anden familie inden for Cladobranchia, Hancockiidae. Vi ser strukturer hos Hancockia californica, der minder meget om cnidosacs (som vi kalder cnidosac-lignende), med kleptocnider, der er anbragt i cnidofag-lignende celler i flere muskelsække i spidsen af hver ceras. Disse strukturer er også fundet hos Hancockia uncinata og H. schoeferti , og i nogle tilfælde blev der fundet cnidosac-lignende strukturer i både cerata og rhinophoralskederne. Homologi-slutninger vedrørende de strukturer, der er fundet i Hancockiidae og dem i Aeolidida, diskuteres i næste afsnit.
Fylogeni af Cladobranchia og udviklingen af cnidosac
Fylogenetiske slutninger
I betragtning af at mange af de molekylære data, der er inkluderet her, stammer fra tidligere offentliggjorte undersøgelser, er den topologi, der er udledt i vores fylogenetiske analyse (Figur 5), i overensstemmelse med den, der er fundet i begge nyere fylogenomiske undersøgelser . Dette arbejde udvider imidlertid tidligere resultater ved at inkludere taxa, der ikke er analyseret i de seneste fylogenomiske undersøgelser, nemlig taxa fra slægterne Phyllodesmium, Caloria, Pruvotfolia, Pteraeolidia, Cratena, Facelina, Glaucus, Calmella, Piseinotecus, Tergipes, Notaeolidia, Embletonia og Charcotia. De fleste af disse falder inden for de klasser, som vi ville forvente på grundlag af tidligere molekylært arbejde: Phyllodesmium er nært beslægtet med Dondice inden for facelinid-kladen, der er søster til Aeolidiidae ; Caloria er støttet inden for den anden facelinid-klade og er nært beslægtet med arter af Pruvotfolia ; Facelina, Glaucus og Cratena er nært beslægtede inden for den anden facelinid-klade ; Calmella er nært beslægtet med Flabellina og Paraflabellina ; og Tergipes falder inden for det, der nu er Fionidae . Imidlertid er placeringen af Pteraeolidia som nært beslægtet med Palisa og Austraeolis inden for den anden facelinid-klade ny for denne undersøgelse, og de molekylære data, der præsenteres her, støtter placeringen af Charcotia inden for søstergruppen til Aeolidida, som tidligere antydet af morfologisk arbejde .
Trods tilføjelsen af alle de nye data, der præsenteres her, forbliver Notaeolidia og Embletonias positioner uklare . Støtten til de nøjagtige positioner for disse to slægter er ringe, og disse taxa ser ud til at bidrage til de lave bootstrap-værdier i bunden af Aeolidida. Dette kan skyldes tiltrækning af lange grene mellem Notaeolidia og Flabellinopsis iodinea , og mellem Embletonia og Unidentia. Morfologiske analyser støtter dog også i det mindste Notaeolidia’s tidligere divergens inden for Aeolidida . Usikkerheden omkring disse fire taxaers affiniteter har konsekvenser for vores forståelse af cnidosacens evolution.
Vi finder også, at individuelle genetræanalyser (og analysen af de tre gener) er i overensstemmelse med tidligere PCR-baserede sekvensanalyser i stor skala . Disse topologier og posterior sandsynligheder understøtter ideen om, at PCR-baserede sekventeringsdata for de anvendte gener (COI, 16S og 18S) giver en vis nytteværdi til at udlede nylige divergenser, men at sekventeringsdata med højt gennemløb er nødvendige for at udlede dybere divergenser.
Cnidosac evolution
Sekventering af cnidarian nematocyster er opstået mindst to gange inden for Cladobranchia baseret på den her præsenterede fylogeni (Fig. 6). Dette resultat indikerer også, at arter inden for Aeolidida, der ikke sekventerer nematocyster, har mistet denne evne, hvilket synes at være sket mindst tre gange. Desuden er den tidlige divergens af Embletoniidae inden for aeolid-fylogenien suggestiv; det tyder på, at strukturen inden for Embletoniidae er en cnidosac, og at manglen på muskulatur omkring cnidosac kan repræsentere et mellemtrin i evolutionen af kleptocnide-sekvestreringen. Der er dog behov for stærkere støtte til slægtskabsforbindelser ved basen af Aeolidida, før der kan drages yderligere slutninger. Vores resultater støtter også flere uafhængige tab af cnidosacen, herunder hos medlemmer af Fiona og Tergipes. Dette ser ud til at skyldes et skift til at tage mest krebsdyr som bytte hos Fiona . En overgang fra hydroider til andre typer organismer kan også have ført til tabet af cnidosacs hos nogle arter af Tergipes .
Forekomsten af en sæk i den distale ende af fordøjelseskirtlen antages at være opstået forud for evnen til at opsamle nematocyster (Figur 6; grå boks), selv om dette resultat er baseret på den hypotese, at de terminale sække, der findes i Charcotiidae og Proctonotidae, er homologe med dem hos Aeolidida. Støtten til denne hypotese er meget lav, og synes derfor usandsynlig på baggrund af vores rekonstruktion. De terminale sække hos Charcotiidae og Proctonotidae anses imidlertid for at fungere som udskillelsesstrukturer, og nogle har opstillet den hypotese, at den aeolidiske cnidosac er en tilpasning af denne sæk til forsvar . Selv om homologien fortsat er usikker, afviser vores rekonstruktion af forfædres tilstand ikke helt denne modifikationshypotese, hvor den distale sæk blev tilpasset til at opsamle nematocyster. Flere morfologiske og molekylære data fra yderligere arter i kladen Charcotiidae + Proctonotidae + Dironidae er nødvendige for yderligere at teste denne hypotese, da denne klade ikke er godt repræsenteret i vores analyse, hvilket kan hindre evolutionære slutninger.
De cnidosak-lignende strukturer i Hancockiidae synes at have udviklet sig uafhængigt af den distale sæk i både Aeolidida og dens søsterklade. Dette understøttes af de fylogenetiske analyser, der er præsenteret her, samt af forskelle i sequestrationsprocessen mellem Hancockia og arter af aeolider. For eksempel ser det ud til, at Hancockia-arter indkapsler nematocyster i lumen af fordøjelseskanalen før transport , i modsætning til aeolider.