Syntéza DNA z difosfátových substrátů pomocí DNA polymeráz

Výsledky a diskuse

Začali jsme testováním Taq (z Thermus aquaticus), vysoce věrné Vent (exo-, z Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, z Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, z Pyrococcus sp. GB-D) a Q5 (exo+) DNA polymerázy v tradičních polymerázových řetězových reakcích (PCR) s deoxyribonukleosidmonofosfátem (dGMP), dNDP a dNTP jako substráty (obr. 1 A a B). Záměna kteréhokoli z dNTP za dNDP podporovala robustní syntézu DNA a další experimenty se dvěma, třemi nebo všemi čtyřmi dNDP místo dNTP podporovaly PCR. Abychom se ujistili, že produkty nejsou výsledkem kontaminace dNTPs a že reakce nejsou zesíleny stabilizátory přítomnými v komerčních pufrech nebo zásobách enzymů, testovali jsme syntézu DNA z purifikovaných dNDPs pomocí domácích pufrů a enzymů. Zařadili jsme také bakteriální replikační enzymy, jako jsou bakteriální replikační DNA polymerázy z termofilního Bacillus stearothermophilus (Bst) a mezofilního Bacillus subtilis (Bsu, velký fragment). Ty spolu s archeálními polymerázami z Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) a Thermococcus gorganarius (Tgo) vykazovaly robustní prodloužení primerů při použití pouhých 100 µM purifikovaných dNDP při 60 °C (kromě Bsu, která byla ve všech případech testována při 37 °C) (obr. 1C). Reakce prodlužování primerů byly účinné pro všechny tyto enzymy, zejména pro Deep Vent, KOD a 9°N. Před inkorporací dA a dC do vznikajícího oligonukleotidu byla pozorována pauza (obr. 1 C a D), což naznačuje, že KM pro dADP a dCDP jsou dostatečně vysoké na to, aby zpomalily prodlužování primeru při koncentraci substrátu 100 µM.

Pro získání mechanistického vhledu do reakce jsme nejprve studovali její účinnost pomocí enzymu Taq. Změna teploty extenze z 50 °C na 72 °C nevedla k žádnému pozorovatelnému rozdílu v množství plnohodnotného produktu. Pro zjednodušení kinetických analýz byly všechny reakce PCR provedeny pomocí dvoukrokového protokolu teplotního cyklování, kdy byl primer v prvním kroku žíhán a prodlužován při teplotě 72 °C a duplex se ve druhém kroku tavil při 95 °C (obr. S1A). Pro porovnání rychlosti využití dNDP s kanonickými dNTP se doba prodlužování měnila od 15 do 120 s. Při 15sekundové době prodlužování vznikl v reakci s dNTP přibližně čtyřnásobek produktu ve srovnání s reakcí s 2minutovou dobou prodlužování, která obsahovala dNDP (obr. S1B). Tyto údaje naznačují, že rychlost inkorporace je u difosfátů pomalejší než u tradičních trifosfátů, což by se dalo očekávat vzhledem k nižší energii základního stavu dNDPs. Dále jsme si položili otázku, zda je za pomalejší rychlost inkorporace zodpovědný jeden nebo všechny čtyři dNDP. Pro přesné měření tvorby produktů byla použita kvantitativní PCR (qPCR). Každý difosfát byl vyšetřen nezávisle kombinací s 0,2 mM ostatních tří dNTP pro amplifikaci dlouhého templátu DNA. Tyto reakce byly normalizovány na kontrolní reakci, která obsahovala 0,2 mM všech čtyř dNTP (obr. S1C). Hodnota 1 znamená, že difosfát je inkorporován stejně účinně jako jeho trifosfátový analog. Tyto výsledky naznačují, že dADP je inkorporován nejméně efektivně (1 mM dADP poskytl ∼60 % 0,2 mM dATP), následován deoxythymidin difosfátem (dTDP) a deoxycytidin difosfátem (dCDP). Na druhou stranu k dosažení stejné účinnosti PCR jako u kontrolní reakce s dGTP je nutné pouze dvojnásobné zvýšení koncentrace dGDP.

Pro přímou analýzu polymerace DNA jsme provedli reakci prodloužení primeru značeného 32P a dlouhého (706 nt) templátu. Koncentrace difosfátu se měnila od 0,1 do 1,0 mM a kombinovala se s 0,2 mM ostatních tří dNTP, podobně jako u reakcí qPCR popsaných výše. Jak se očekávalo, zvyšující se koncentrace dADP snižovala dobu potřebnou k vytvoření plnohodnotného produktu (obr. 1E). Zastavení podél délky templátové DNA bylo pozorováno výhradně v případě dADP, což naznačuje, že polymeráza se během inkorporace substrátů dADP zastavuje (obr. 1E). Na druhou stranu absence pauzy v reakci s dTDP naznačuje, že dTDP byl využit efektivněji než dADP (obr. S2A), jak naznačuje analýza qPCR (obr. S1A). Analýza tvorby produktů naznačila, že koncentrace dADP potřebná k dosažení poloviční maximální rychlosti je ∼420 µM (obr. S2B), což je o více než řád více než KM pro dNTP naměřená dříve (16 a 24 µM) (5, 6). V blízkosti nasycující koncentrace dADP je DNA plné délky syntetizována přibližně za 30 s a vzhledem k tomu, že 706-nt sekvence obsahuje 182 adenosinů, je průměrná rychlost využití dADP nejméně ∼6 s-1. To je přibližně o řád pomalejší než průměrná rychlost využití dNTPs polymerázou Taq (kcat = 47 s-1) a je v rozmezí 1,5násobku kcat Pfu (7).

Pro další srovnání kinetiky syntézy DNA na dlouhých templátech z dNDPs a dNTPs jsme použili jednořetězcový DNA (ssDNA) templát plazmidu M13mp18 o délce 7 249 nt (8). Bsu (při 37 °C), Bst a Taq (při 60 °C) polymerázy vykazovaly robustní syntézu DNA z dNDP (obr. S2C). Rychlost syntézy DNA jsme měřili pomocí fluorescence interkalátoru SYTO9, pozorované termálním cyklérem v reálném čase při různých koncentracích dNDP a dNTP (obr. S2D) (9). Graf závislosti těchto rychlostí na koncentraci nukleotidů odhalil zdánlivou KM ∼0,4 mM pro dNDP a maximální rychlost syntézy, která je pro dNDP asi 17krát nižší než pro dNTP (obr. S2E). Tyto výsledky ukazují v přímém srovnání za identických podmínek, že rychlost syntézy DNA z dNDPs je o něco více než řád nižší než z dNTPs a že Vmax/KM je tedy asi 400krát nižší pro dNDPs než pro dNTPs.

Polymerizační reakce s kanonickými trifosfátovými substráty zvyšuje délku vznikajícího vlákna DNA o jeden nukleotid, čímž se uvolňuje PPi (3). Při zpětné reakci, pyrofosforéze, se primer zkrátí o jeden nukleotid a uvolní se dNTP. Analogicky při použití dNDP jako substrátu polymerázy uvolňují fosfáty a zpětnou reakcí je fosfolýza DNA (obr. 2A). Abychom potvrdili, že polymerázy využívají dNDPs přímo a nevyužívají dosud neznámou enzymatickou aktivitu (nebo kopurifikovanou nukleotid difosfát kinázu), která přeměňuje dva dNDPs na dNTP a dNMP, použili jsme purifikované dNDPs a analyzovali produkty reakce prodlužování primeru. Produkci fosfátu jsme měřili pomocí fluorescenčního senzoru, který je odvozen od bakteriálního proteinu vázajícího fosfát a vykazuje vysokou specifitu pro fosfát (10). Zjistili jsme, že v přítomnosti purifikovaných dNDP a Taq DNA polymerázy se fosfát vytváří (obr. 2B), ale v experimentech bez polymerázy se nevytváří. V kontrolních experimentech s dNTPs byla produkce fosfátu pozorována, ale její rychlost byla pomalejší a nezávislá na enzymu, což naznačuje, že detekovaný fosfát je výsledkem degradace dNTP na dNDP a fosfát a nesouvisí se syntézou DNA. Tyto výsledky potvrdily, že Taq přímo využívá dNDP jako substráty a uvolňuje fosfát jako vedlejší produkt syntézy DNA. Když jsme měřili množství fosfátu vzniklého při prodlužování primerů na výše popsané 7 249-nt M13 ssDNA, zjistili jsme, že při použití 1,6 nM templátu vzniklo ∼1-11 µM fosfátu nad produkcí fosfátu na pozadí z degradace dNDP (obr. S3A). Tato koncentrace fosfátu odpovídá ∼2-6 000 molekulám na DNA nebo přibližně 0,1-0,9 templátu zkopírovaného pomocí dNDP. Široké rozmezí je důsledkem poměrně velkého fosfátového pozadí ve výchozím materiálu a reakce pozadí odečtené od signálu v reakci prodlužování primerů.

Pro ověření, že reakce nevytvářejí dNTP z dNDP, jsme inkubovali Taq polymerázu s 250 µM dCDP a dTDP a rozdělili reakce pomocí iontově-výměnné chromatografie (obr. S3B). Tato analýza neodhalila žádné nové molekulární formy odpovídající mono- nebo trifosforylovaným nukleotidům v reakci obsahující enzym ve srovnání s reakcí bez enzymu, což ukazuje na nedostatek fosforyltransferázové aktivity v enzymovém preparátu a dále podporuje přímé využití dNDP při syntéze DNA.

Jak bylo popsáno výše, reakce se substráty dNDP uvolňují anorganický fosfát (Pi), a zpětnou reakcí je tedy fosforylace DNA (obr. 2A). Abychom otestovali účinnost této zpětné reakce, zkoumali jsme fosfolýzu 5′ 32P značeného primeru annealizovaného na templátové vlákno inkubací s enzymem a 10 mM Pi. Obr. 2C ukazuje odstranění koncového 3′ nukleotidu z primerového vlákna Taq DNA polymerázou v přítomnosti Pi a PPi, což dokazuje, že Taq DNA polymeráza může podstoupit reverzní reakci polymerace DNA z dNTP i dNDP. Analýza termofilních polymeráz Bst, Deep Vent, KOD (obr. S4A), 9°N, Tgo a mezofilní polymerázy Bsu rovněž prokázala fosforylaci DNA (obr. S4B), i když v menší míře. Kontrolní reakce s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I Escherichia coli, která nepřijímá dNDP jako substrát, byla také zkoumána (obr. S4C) a ukázala, že přítomnost PPi, ale nikoli Pi, vede ke zkrácení primeru.

Pro další analýzu zpětné reakce jsme připravili dsDNA značenou vnitřně 32P-fosfátem provedením reakce prodlužování primeru pomocí α-32P-dATP, po které následovalo přečištění PAGE. Produkty reverzní reakce jsme analyzovali pomocí TLC s aniontovou výměnou (polyethylenimin). Podle očekávání inkubace vnitřně značené DNA s Taq polymerázou a pyrofosfátem poskytla produkty, které se spojily s dATP. Reakce v přítomnosti fosfátu produkovaly rychleji migrující druhy odpovídající dADP a reakce bez fosfátu nebo pyrofosfátu neprodukovaly žádné migrující druhy, což naznačuje, že v přítomnosti samotné Taq polymerázy zůstala DNA neporušená (obr. 2D) a potvrzuje, že reverzní reakce je fosfolýza DNA.

Nakonec analýza kinetiky reverzní reakce závislé na substrátu odhalila KM ∼10 ± 5 mM (n = 9) a 57 ± 5 µM (n = 5) pro fosfát, resp. pyrofosfát, ačkoli nízká rozpustnost fosforečnanu hořečnatého nad 10 mM nám znemožnila získat přesná měření (obr. 2E). Krystalové struktury DNA polymeráz s pyrofosfátem nebo kyselinou fosfonoformovou v aktivních místech vykazují coulombickou interakci s proteinem (11⇓-13). Dvousetnásobný poměr mezi KM obou substrátů odpovídá ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) při 72 °C, což je vazebná energie přibližně rovná iontové interakci mezi dodatečným fosfátem a kompenzačním kationtem na proteinu a podporuje model, ve kterém je fosfát/pyrofosfát rozpoznáván hlavně prostřednictvím interakce náboj-náboj. Odhady maximálních rychlostí zpětné reakce měly podobný trend: za těchto podmínek byla Vmax 0,0010 ± 0,0005 s-1 pro fosfát a 0,205 ± 0,005 s-1 pro pyrofosfát, což opět ukazuje přibližně 200násobný poměr mezi oběma aktivitami. Souhrnně lze říci, že pod saturačními koncentracemi obou substrátů je fosfátová reakce asi 4 × 104krát méně účinná, což naznačuje, že fosfolýza DNA nepředstavuje významnou hrozbu pro stabilitu genomu.

Pro získání dalších poznatků o syntéze DNA z nízkoenergetických substrátů (dNDP a Pi) jsme změřili aktivační energie pomocí Arrheniovy analýzy přímých a zpětných reakcí. Protože jednomolekulová měření konformačních změn spojených s rozpoznáním a inkorporací správných dNTPs odhalila rychlejší pohyb proteinu než pozorovaná reakční kinetika (14), rychlost limitující krok dopředné reakce v Taq polymeráze pravděpodobně souvisí s chemickým krokem nebo předkatalytickou přestavbou aktivního místa, která závisí na interakci se substrátovými fosfáty. Pozorovali jsme, že Vmax dopředné i zpětné reakce je nižší pro dNDP a fosfát než pro dNTP a pyrofosfát, což naznačuje, že rychlost limitující krok je citlivý na fosforylační stav substrátů. Jak předkatalytické přeskupení (jako je zarovnání zbytků na aktivním místě a navázání katalytického iontu Mg2+ ), tak chemický krok však mohou být ovlivněny fosforylací substrátu; proto může být v přítomnosti dNDP rychlost limitující kterýkoli z těchto kroků za předpokladu, že do mechanismu nezavádějí nový pomalý konformační krok. U Pol β byly dříve navrženy podobné rychlostní konstanty těchto dvou kroků (15) a vypočtené aktivační energie pro přímou a zpětnou reakci využívající vysokoenergetické substráty (dNTP a pyrofosfát) se liší pouze o 15 kJ/mol (4). V případě termofilních enzymů Taq a Klentaq1 se aktivační energie dopředné reakce značně liší a pohybuje se od 90 do 125 kJ/mol v závislosti na experimentálních podmínkách a pravděpodobně i na identitě reagujících nukleotidů (8, 16), zatímco aktivační energie pyrofosfrolýzy nebyla, pokud je nám známo, experimentálně stanovena.

Analyzovali jsme rychlosti inkorporace jednotlivých nukleotidů 50 µM dCDP, dADP a dTDP, naskládaných na dA, dC, respektive dA, během reakce prodlužování primeru. Arrheniova analýza ukázala lineární závislost ln(kobs) na 1/T pro experimenty pod 60 °C a odhalila aktivační energie 85 ± 14, 108 ± 11 a 112 ± 15 kJ/mol pro tři nukleotidy (obr. 3 A a B; n = 6 pro každý nukleotid). Arrheniova analýza zpětné reakce s 0,4 mM fosfátu, při níž vzniká molekula dADP, odhalila velkou aktivační energii 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), která je v souladu s pozorovanou pomalou rychlostí fosforylace DNA Taq (obr. 3 A a B) a představuje významný nárůst oproti vypočtené aktivační energii pyrofosforylace (92 kJ/mol u Pol β) (4). Aktivační energie přímých a zpětných reakcí pro dADP se tedy liší o ∼30 kJ/mol, což představuje silnou odchylku ve prospěch syntézy DNA. Toto vychýlení pro přímou reakci má za následek nižší požadavek na sekvestraci fosfátového produktu navazující metabolickou cestou, na rozdíl od syntézy DNA založené na dNTP a hydrolýzy pyrofosfátu anorganickými pyrofosfatázami. Pokud navíc pre-katalytické konformační změny v Taq polymeráze nejsou ovlivněny nízkoenergetickými substráty a chemický krok je limitující pro rychlost, může využití dNDP a fosfátů přinést nové experimentální poznatky o enzymatické katalýze syntézy DNA.

Naše studie ukazuje, že Taq a několik dalších enzymů z rodiny A i B DNA polymeráz, včetně replikačních enzymů termofilních i mezofilních bakterií, mohou nahradit kanonické trifosfátové substráty difosfátovými analogy. První důkazy o postradatelnosti γ-fosfátu v nukleotidovém substrátu vyplynuly ze studií reverzní transkriptázy HIV-1 a DNA polymerázy gp43 bakteriofága RB69. Varianty HIV-1 RT, které zrušily elektrostatickou interakci mezi γ-fosfátem vstupujícího dNTP a polymerázou, vedly k zachování aktivity, i když mnohem pomaleji (17⇓-19), a bakteriofágová RB69 DNA polymeráza gp43 vykazovala podobnou aktivitu (20). Oba tyto virové enzymy přijímají dNDP jako substráty, ale s KM (nebo KD), které jsou 500krát a 17krát vyšší, a rychlostními konstantami, které jsou 100krát a 400krát nižší než pro dNTP u HIV-1 RT a RB69 gp43 (20, 21). Naše studie ukazuje, že buněčné replikační polymerázy mají tuto aktivitu, popisuje afinity k substrátům a aktivační energie pro přímou i zpětnou reakci a naznačuje, že syntéza DNA z dNDP je poměrně účinná, zejména pro termostabilní enzymy.

Naše výsledky naznačují, že replikace DNA může probíhat za použití dNDP jako substrátů. U termofilů může být replikace genomu méně citlivá na energetický náboj buňky než u mezofilů, protože termostabilní polymerázy mohou přijímat difosforylované i trifosforylované substráty. Replikace DNA je tedy méně ovlivněna intracelulárním poměrem ATP/ADP a relativně vysoká účinnost, s níž je DNA syntetizována při zvýšených teplotách, naznačuje, že termofilové se mohou zcela obejít bez trifosforylovaných substrátů. Paleobiologické důkazy navíc naznačují, že poslední společný předek naší biosféry byl termofil (22⇓-24), a naše studie naznačuje, že disfosforylované substráty mohly být pro replikaci genomu raných organismů dostatečné, což zmírnilo potřebu metabolismu vysokoenergetických trifosforylovaných metabolických meziproduktů. V takovém případě by difosforyláty mohly být považovány za meziprodukty v evoluci vysokoenergetických metabolitů a mohly by zahrnovat ancestrální stavební kameny raných genomů, jako jsou ribonukleotidy nebo jednodušší nukleové kyseliny.

DNA polymeráza hraje významnou roli v mnoha biotechnologiích. Použití zde uvedených difosfátových substrátů má potenciál umožnit praktické začlenění drahých analogů, jako jsou izotopicky značené nebo chemicky modifikované nukleotidy, čímž se eliminuje potřeba náročných syntéz trifosfátů. Tato vlastnost DNA polymeráz může také poskytnout metodu pro detekci nukleotidů používaných při vysoce výkonném sekvenování DNA. Dvě běžné metody detekují odcházející skupinu PPi spojenou s prodloužením primeru, a to buď pomocí sekundárního chemiluminiscenčního testu, nebo sledováním změny lokálního pH (25, 26). Použití substrátu dNDP dává Pi, a nabízí tak další možnost rozlišit inkorporované nukleotidy. Toto rozšířené zhodnocení schopností DNA polymerázy také naznačuje, že zkoumání dalších enzymů závislých na trifosfátech by mohlo odhalit toleranci k méně energetickým, snáze dostupným difosfátovým substrátům jako evolučním meziproduktům

.