PMC

Nedávný editorial Dayana a Wraitha v tomto časopise upozornil na problémy při vývoji nových imunoterapií po katastrofální studii TGN1412. Tento přehled uvádí některé poznatky získané z mnoha klinických studií anti-D, které mohou být relevantní pro translační imunologii.

Prevence hydrops fetalis nebo Rhesus hemolytické choroby plodu a novorozence (HDFN) pomocí profylaktické anti-D je nejúspěšnější klinickou aplikací protilátkové imunosuprese. K HDFN dochází poté, co je D-negativní žena po fetomaternálním krvácení (FMH) imunizována fetálními D-pozitivními červenými krvinkami; vzniklé IgG anti-D se přenáší přes placentu a způsobuje destrukci fetálních červených krvinek makrofágy sleziny. Ve 40. letech 20. století, kdy byla příčina tohoto onemocnění poprvé rozpoznána, se rodilo 1 % dětí s HDFN a 40 % z nich zemřelo . Nejčastěji se na vzniku podílí protilátka anti-D. RhD polypeptid na červených krvinkách je nejvíce imunogenní z antigenů krevních skupin, protože chybí v buňkách D-negativních jedinců, kterým chybí gen RHD .

HDFN je nyní vzácná, částečně díky zlepšené péči o plod a novorozence, ale hlavně díky prevenci primární imunizace vnímavých D-negativních žen profylaktickými IgG anti-D . Od roku 1968, po úspěšných klinických studiích ve Velké Británii a USA , se anti-D podává 10 % všech žen po porodu, což vedlo ke snížení výskytu onemocnění přibližně o 95 %. Příčinou HDFN je nyní méně než 30 perinatálních úmrtí ročně. V roce 2002 Národní institut pro zdraví a klinickou excelenci (NICE) doporučil, aby byla všem D-negativním ženám vedle postnatální profylaxe podávána rutinní prenatální anti-D profylaxe s cílem ještě více snížit míru imunizace. Intravenózní (IV) anti-D se nyní také terapeuticky používá k léčbě některých D-pozitivních pacientů s imunitní trombocytopenickou purpurou (ITP) . Poptávka po anti-D se tedy zvyšuje.

Imunoglobulin anti-D se připravuje ze sdružené hyperimunní lidské plazmy. Problémy s virologickou bezpečností a v poslední době i s variantní Creutzfeld-Jakobovou chorobou (vCJD) již mnoho let stimulují hledání alternativních dodávek. Ve Spojeném království se nyní plazma pro frakcionaci získává od severoamerických dárců kvůli obavám, že britští dárci jsou latentními nositeli vCJD. S cílem nahradit polyklonální anti-D připravené z lidské plazmy biotechnologickými verzemi pro diagnostické i klinické použití byly vyrobeny stovky monoklonálních (mAb) nebo rekombinantních (rAb) anti-D protilátek. Všechny jsou odvozeny z lidských imunoglobulinových genů nebo buněk B, protože myši antigen RhD nerozpoznávají. Byly použity různé expresní systémy, včetně lidských B-buněčných linií, ovariálních buněk čínského křečka (CHO), myších a lidských heterohybridomů a myelomů potkanů.

Ačkoli přesný mechanismus potlačení D imunizace podáním pasivních IgG anti-D ještě nebyl objasněn , je známo, že D-pozitivní červené krvinky jsou rychle odstraněny do sleziny makrofágy prostřednictvím interakcí s IgG Fc receptorem (FcγR) a stávají se neimunogenními. Ve skutečnosti, aby se zajistilo, že profylaktická anti-D bude pravděpodobně účinná při prevenci imunizace D na velkou FMH, jsou ženy testovány o 2-3 dny později, aby se zkontrolovalo, zda jsou fetální buňky vyčištěny z oběhu . Jinak mají alogenní erytrocyty po FMH nebo transfuzi dlouhé přežívání. Aloimunitní odpovědi se vyvíjejí pomalu, obvykle 5-15 týdnů pro anti-D . To je pravděpodobně způsobeno tím, že u nich chybí signály nebezpečí (z cizích molekul), takže je imunitní systém nerozpozná, dokud se nestanou senescentními, což pak stimuluje jejich fagocytózu prostřednictvím fosfatidylserinových receptorů . Bez RhD profylaxe se přibližně 17 % D-negativních žen po těhotenství s D-pozitivním plodem imunizuje . Tento výskyt je nižší než u záměrně imunizovaných normálních osob (reaguje až přibližně 85 % ), protože u většiny žen jsou objemy FMH příliš malé na to, aby byly červené krvinky imunogenní . Těhotné ženy mohou vytvářet robustní aloimunitní odpovědi a zároveň tolerovat svůj poloalergický plod.

Za posledních 20 let bylo v 15 studiích „first-in-man“ testováno 19 anti-D mAbs a rAbs. Ty byly nedávno přezkoumány a jsou zde shrnuty. Nevyskytly se žádné závažné nežádoucí účinky. Biologické testy in vitro fagocytózy a hemolýzy zprostředkované FcγR pomocí lidských efektorových buněk jsou dobře zavedené a byly použity pro screening. V klinických studiích se hodnotila schopnost protilátek odstranit z oběhu malé objemy (méně než 1 %) D-pozitivních červených krvinek a v některých studiích se pak také zjišťovala schopnost anti-D zabránit D-imunizaci. Mnoho mAb a rAb bylo přímo srovnáváno s polyklonálními anti-D.

Byla pozorována velká heterogenita v účinnosti protilátek (tabulka 1). Dvě mAbs odvozené z lidských B-lymfoblastoidních buněčných linií, BRAD-3 a BRAD-5, zprostředkovaly rychlou clearance červených krvinek a zabránily imunizaci D téměř stejně účinně jako polyklonální anti-D, ačkoli byla použita třikrát až čtyřikrát vyšší dávka . Plazmatický poločas BRAD-3 a BRAD-5 byl normální, ale biologická dostupnost byla poloviční než u polyklonální anti-D . Když byly tyto protilátky exprimovány jako rAbs v buňkách CHO, clearance autologních D-pozitivních červených krvinek byla pomalejší než u původních mAbs . Rozsáhlá studie s použitím další anti-D rAb odvozené z CHO, MonoRho, poskytla neuspokojivé výsledky, clearance červených krvinek byla velmi variabilní, obvykle velmi pomalá a bez korelace s dávkou anti-D . Částečně to lze vysvětlit velmi nízkou biologickou dostupností MonoRho. Subjekty však neprodukovaly anti-D, ačkoli jim nebyly podány injekce D-pozitivních červených krvinek, aby se určil jejich stav imunizace D . MAbs produkované myšími myelomovými buněčnými liniemi (jako myší a lidské heterohybridy) také vykazovaly velkou variabilitu v clearance červených krvinek, ale nečekaně se více než polovina příjemců rychle imunizovala proti D , což je dvakrát více, než by se stalo při použití samotných červených krvinek . Tyto anti-D tedy měly adjuvantní účinek a posilovaly imunitní odpověď na D-pozitivní červené krvinky, místo aby jí zabránily, jak bylo zamýšleno. Pozdější studie s použitím anti-D rAbs produkovaných myelomovými buňkami potkanů ukázaly, že podporují extrémně rychlou clearance autologních červených krvinek, rychlejší než polyklonální anti-D . Účinek změny buněčné linie exprimující FOG-1 z myší na potkaní byl nápadný a změnil clearance z velmi pomalé a neúplné na velmi rychlou . V posledně jmenované studii to bylo spojeno s hemolýzou, určitou clearance do jater a febrilními reakcemi . K těmto reakcím nedochází po profylaxi polyklonálním anti-D. Neočekávaně mutanty rAb FOG-1, které postrádaly interakce FcγR in vitro, rovněž zprostředkovaly rychlou clearance červených krvinek, ačkoli se očekávalo normální přežívání . Tyto IgG anti-D se musely vázat na jiné receptory než IgG FcγR.

Mnoho anti-D mAbs a rAbs se nechovalo jako polyklonální anti-D. Žádná nebyla tak účinná a některé z buněčných linií hlodavců dokonce vedly k nežádoucím imunitním reakcím. Reakce in vivo byly určeny především druhem buněčné linie produkující protilátky, nikoliv proteinovými sekvencemi. Příčinou těchto neočekávaných a možná škodlivých reakcí může být to, že IgG anti-D produkované ze zvířecích buněk interagovaly se složkami vrozeného imunitního systému. Nejpravděpodobnějším vysvětlením jsou rozdíly ve složení jejich oligosacharidů.

Typ glykosylace IgG závisí na buňce, ve které je produkován, a je druhově specifický. Struktury jako N-glykolyl kyseliny neuraminové a oligosacharidy s vysokým obsahem manózy na IgG hlodavců mohou být rozpoznány jako cizorodé receptory vrozené imunity (PRR) s následnou prozánětlivou reakcí. PRR zahrnují buněčné asialoglykoproteinové a manózové receptory. Po navázání anti-D na D-pozitivní červené krvinky mohly stimulovat protilátkové odpovědi na antigen D. V plazmě může lektin vázající mannan způsobit hemolýzu zprostředkovanou komplementem, pokud se naváže na manózové zbytky anti-D na červené krvince. Endogenní IgG protilátky rozpoznávající galaktózu-α1,3-galaktózu na myším IgG by mohly vázat anti-D exprimující tento oligosacharid. Nedávno endogenní IgE anti-galaktóza-α1,3-galaktóza způsobily reakce přecitlivělosti u některých pacientů, kterým byl podán cetuximab (imunoterapeutikum proti rakovině) produkovaný v myších myelomových buňkách SP2/0 . Nedostatek kyseliny sialové na mnoha anti-D mAbs a rAbs by způsobil, že by IgG po navázání FcγR byly prozánětlivé .

Polyklonální anti-D mohou být v různých klinických situacích buď prospěšné, nebo smrtelné. Důležitým faktorem je dávka cílových erytrocytů. Clearance malých objemů erytrocytů, jako je tomu u FMH, je „tichý“, nezánětlivý, nehemolytický proces. Pokud však D-pozitivní jedinec dostane velké dávky anti-D, jako je tomu u plodu trpícího RhD hemolytickou chorobou nebo vzácně u pacientů s ITP léčených intravenózně anti-D, může dojít k závažné hemolýze. V těchto příležitostně fatálních případech jsou dalšími příznaky obvykle hydrops (otok) u HDFN a akutní hemoglobinémie, hemoglobinurie a diseminovaná intravaskulární koagulace u pacientů s ITP . Většina případů akutní hemolýzy byla považována za důsledek robustní extravaskulární hemolýzy (zprostředkované makrofágy) spíše než intravaskulární hemolýzy . I bez těchto závažných nežádoucích účinků se u pacientů s ITP po infuzi intravenózního anti-D nezřídka objevuje horečka a zimnice , což svědčí o zánětlivých reakcích. Pokud by tedy pacienti s ITP byli léčeni prozánětlivými anti-D mAbs nebo rAbs namísto současných polyklonálních anti-D, mohla by následovat složitá řada nezamýšlených a potenciálně nebezpečných reakcí.

V návaznosti na studii fáze 1 TGN1412 mohou být některé aspekty klinických studií anti-D užitečné pro budoucí vývoj a regulaci studií „first-in-man“ jiných imunoterapeutik , zejména těch, která jsou zaměřena na buňky v krvi (tabulka 2). Důležitá je zejména volba počáteční dávky. Ve všech pracích na lidech byly použity nízké dávky červených krvinek a anti-D . V některých studiích, například u BRAD-3 , byly autologní červené krvinky (0-5 ml) potaženy anti-D ex vivo a poté promyty a injikovány, čímž se minimalizovala dávka protilátky a zmírnila možnost nežádoucích účinků. Clearance takto malých objemů červených krvinek mohla být přesně sledována, pokud byly izotopicky značeny. Když se tato protilátka ukázala jako bezpečná a účinná, byly pak anti-D a červené krvinky podávány odděleně, aby se lépe simulovala klinická situace. Důkazy o zánětlivých reakcích při podávání nízkých dávek anti-D a erytrocytů by měly zajistit opatrnost při studiích rozšiřování.

Závěrem, rozsáhlé údaje ze studií anti-D mAbs a rAbs u lidí naznačují, že jejich glykosylace mohla mít silný vliv na modulaci jejich in vivo aktivit. Některé rAbs spíše zvyšovaly než snižovaly výskyt D imunizace, jedna způsobovala škodlivé hemolytické reakce a jedna měla extrémně nízkou biologickou dostupnost. Tyto účinky nebyly z provedených in vitro studií předpokládány. V budoucnu by se při vývoji rekombinantních glykoproteinů pro humánní terapii měla brát v úvahu možnost, že může dojít k interakcím mezi nehumánními oligosacharidy a jinými buňkami nebo molekulami, než je zamýšlený ligand.

.