Fluorescence

Fluorescence je luminiscence, která se většinou vyskytuje jako optický jev u chladných těles, kdy molekulární absorpce fotonu o určité vlnové délce vyvolá emisi jiného fotonu o delší vlnové délce. Látka, která fluoreskuje, se nazývá fluorofor. Energetický rozdíl mezi absorbovanými a emitovanými fotony končí jako molekulární vibrace nebo teplo. Obvykle je absorbovaný foton v ultrafialové oblasti a emitované světlo ve viditelné oblasti, ale to závisí na použitém fluoroforu a dalších faktorech.

Fluorescence je pojmenována podle minerálu fluoritu, složeného z fluoridu vápenatého, který tento jev často vykazuje. Fluoreskuje také celá řada dalších minerálů a organických materiálů, které se používají pro řadu různých aplikací. Fluorescence je například užitečná pro osvětlení a značení molekul v analytické chemii a biochemii. Fluorofory se používají ke značení buněk, protilátek a dalších biologických struktur a k určení jejich struktury a způsobu působení.

Příklady fluoreskujících materiálů

Kameny, minerály, vlákna a mnoho dalších materiálů, se kterými se lze setkat v kriminalistice nebo ve vztahu k různým sbírkovým předmětům, mohou mít výraznou fluorescenci nebo mohou různě fluoreskovat pod krátkovlnným ultrafialovým, dlouhovlnným ultrafialovým nebo rentgenovým zářením.

Mnoho druhů kalcitu a jantaru fluoreskuje pod krátkovlnným UV zářením. Rubíny, smaragdy a diamant Hope vykazují červenou fluorescenci pod krátkovlnným UV zářením; diamanty také emitují světlo pod rentgenovým zářením.

Ropa (petrolej) fluoreskuje v různých barvách, od matně hnědé u těžkých olejů a dehtů až po jasně žlutavou a modravě bílou u velmi lehkých olejů a kondenzátů. Tento jev se používá při průzkumu ropných vrtů k identifikaci velmi malých množství ropy ve vrtných vývrtech a vzorku jádra.

Organické kapaliny, jako jsou směsi anthracenu v benzenu nebo toluenu nebo stilbenu ve stejných rozpouštědlech, fluoreskují při ozáření ultrafialovým nebo gama zářením. Doba rozpadu této fluorescence je řádově nanosekundy, protože doba trvání světla závisí na době života excitovaných stavů fluoreskujícího materiálu, v tomto případě anthracenu nebo stilbenu.

Použití

Existuje mnoho přírodních a syntetických sloučenin, které vykazují fluorescenci a mají řadu aplikací. Fluorescenci využívají někteří hlubokomořští živočichové, jako je například sivěnka.

Osvětlení

Běžná fluorescenční trubice spoléhá na fluorescenci. Uvnitř skleněné trubice je částečné vakuum a malé množství rtuti. Elektrický výboj v trubici způsobuje, že atomy rtuti vyzařují světlo. Vyzařované světlo je v ultrafialové (UV) oblasti, je neviditelné a škodlivé pro většinu živých organismů. Trubice je obložena vrstvou fluorescenčního materiálu, nazývaného luminofor, který absorbuje ultrafialové záření a znovu vyzařuje viditelné světlo. Zářivkové osvětlení je ve srovnání se žárovkovou technologií energeticky velmi úsporné, ale vytvářené spektrum může způsobit, že některé barvy vypadají nepřirozeně.

V polovině 90. let 20. století byly k dispozici diody vyzařující bílé světlo (LED), které fungují podobným procesem. Obvykle vlastní polovodič vyzařující světlo produkuje světlo v modré části spektra, které dopadá na sloučeninu luminoforu nanesenou na čipu; luminofor fluoreskuje od zelené po červenou část spektra. Kombinace modrého světla, které prochází luminoforem, a světla vyzařovaného luminoforem vytváří čistou emisi bílého světla.

Moderní rtuťové pouliční osvětlení se údajně vyvinulo ze zářivky.

Svítící tyčinky oxidují ester fenyl oxalátu a vytvářejí světlo.

Kompaktní zářivkové osvětlení (CFL) je stejné jako jakákoli typická zářivka s výhodami. Je samočinné a používá se k nahrazení žárovek ve většině aplikací. Produkují čtvrtinu tepla na lumen oproti žárovkám a vydrží zhruba pětkrát déle. Tyto žárovky obsahují rtuť a musí se s nimi zacházet a likvidovat opatrně.

Analytická chemie

Fluorescenci v několika vlnových délkách lze detekovat maticovým detektorem, pro detekci sloučenin z toku HPLC. Také desky pro tenkovrstvou chromatografii (TLC) lze vizualizovat, pokud jsou sloučeniny nebo barvicí činidlo fluorescenční.

Otisky prstů lze vizualizovat pomocí fluorescenčních sloučenin, jako je ninhydrin.

Biochemie a medicína

Biologické molekuly lze jednoduchou chemickou reakcí označit fluorescenční chemickou skupinou (fluoroforem) a fluorescence značky umožňuje citlivou a kvantitativní detekci molekuly. Příklady:

• Fluorescenční mikroskopie tkání, buněk nebo subcelulárních struktur se provádí tak, že se protilátka označí fluoroforem a protilátka najde ve vzorku svůj cílový antigen. Označení více protilátek různými fluorofory umožňuje vizualizaci více cílů v rámci jednoho snímku.
• Automatické sekvenování DNA metodou zakončení řetězce; každá ze čtyř různých bází zakončujících řetězec má svou vlastní specifickou fluorescenční značku. Když jsou označené molekuly DNA odděleny, fluorescenční značka je excitována zdrojem UV záření a identita báze ukončující molekulu je identifikována podle vlnové délky emitovaného světla.
• Detekce DNA: Sloučenina ethidium bromid, pokud v roztoku volně mění svou konformaci, má velmi malou fluorescenci. Fluorescence ethidiumbromidu se výrazně zvýší, když se naváže na DNA, takže tato sloučenina je velmi užitečná při vizualizaci umístění fragmentů DNA v elektroforéze v agarózovém gelu. Ethidium bromid může být toxický; bezpečnější alternativou je barvivo SYBR Green.
• Mikroarray DNA
• Imunologie:
• FACS (fluorescenčně aktivované třídění buněk)
• Fluorescence se používá ke studiu struktury a konformací DNA a proteinů pomocí technik, jako je fluorescenční rezonanční přenos energie, který měří vzdálenost na angstromové úrovni. To je důležité zejména u komplexů více biomolekul.
• Aequorin z medúzy Aequorea victoria vytváří v přítomnosti iontů Ca2+ (chemickou reakcí) modrou záři. Byl použit k zobrazení toku vápníku v buňkách v reálném čase. Úspěch s aequorinem podnítil další výzkum A. victoria a vedl k objevu zeleného fluorescenčního proteinu (GFP), který se stal mimořádně důležitým výzkumným nástrojem. GFP a příbuzné proteiny se používají jako reportéry pro celou řadu biologických událostí, včetně například subcelulární lokalizace. Úroveň genové exprese se někdy měří propojením genu pro produkci GFP s jiným genem.

Také mnoho biologických molekul má vlastní fluorescenci, kterou lze někdy využít bez nutnosti připojovat chemickou značku. Někdy se tato vnitřní fluorescence mění, když je molekula v určitém prostředí, takže lze měřit distribuci nebo vazbu molekuly. Například bilirubin je vysoce fluorescenční, když se váže na specifické místo na sérovém albuminu. Zinkový protoporfyrin, který se tvoří ve vyvíjejících se červených krvinkách místo hemoglobinu, když není k dispozici železo nebo je přítomno olovo, má jasnou fluorescenci a může být použit k detekci těchto problémů.

Od roku 2006 roste počet aplikací fluorescence v biomedicínských biologických a příbuzných vědách. Metod analýzy v těchto oborech také přibývá, i když se stále nešťastnějším názvoslovím v podobě zkratek, jako např: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. Většina těchto technik se opírá o fluorescenční mikroskopy. Tyto mikroskopy používají k excitaci fluorescence ve sledovaných vzorcích zdroje světla o vysoké intenzitě, obvykle rtuťové nebo xenonové výbojky, LED nebo lasery. Optické filtry pak oddělují excitační světlo od emitované fluorescence, kterou lze detekovat okem nebo pomocí (CCD) kamery či jiných detektorů světla (fotonásobiče, spektrografy atd.). Probíhá mnoho výzkumů s cílem zlepšit možnosti těchto mikroskopů, používaných fluorescenčních sond a aplikací, pro které se používají. Zvláštní pozornost si zaslouží konfokální mikroskopy, které používají dírku k dosažení optického řezu – umožňují kvantitativní, 3D zobrazení vzorku.

Bezpečnost

Fluorescenční žárovky vytvářejí mnohem méně odpadního tepla než žárovky a halogenové žárovky. Halogenové žárovky se podílejí na velkém počtu požárů a také žárovky s sebou nesou vyšší riziko požáru než zářivky, a to kvůli odpadnímu teplu. Žárovky se mohou převrhnout náhodou nebo někdy vlivem událostí, jako je zemětřesení. Používání zářivek tak může být prostředkem prevence náhodných požárů. Zářivky však mohou obsahovat rtuť a rozbití takové žárovky by mohlo vést k nákladnému úniku rtuti.

Teoretické úvahy

Fotochemie

Fluorescence nastává, když molekula nebo kvantový bod po elektronické excitaci relaxuje do základního stavu.

Excitace: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \to S_{1}}.

Fluorescence (emise): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } , zde h ν {\displaystyle h\nu } je obecný výraz pro energii fotonu, kde: h = Planckova konstanta a ν {\displaystyle \nu } = frekvence světla. (Konkrétní frekvence excitujícího a emitovaného světla závisí na konkrétním systému.)

Stav S0 se nazývá základní stav fluoroforu (fluorescenční molekuly) a S1 je jeho první (elektronicky) excitovaný stav.

Molekula ve svém excitovaném stavu S1 může relaxovat různými konkurenčními cestami. Může projít „nezářivou relaxací“, při níž se excitační energie odvádí jako teplo (vibrace) do rozpouštědla. Excitované organické molekuly mohou také relaxovat přeměnou na tripletový stav, který může následně relaxovat prostřednictvím fosforescence nebo sekundárním nezářivým relaxačním krokem.

K relaxaci stavu S1 může dojít také interakcí s druhou molekulou prostřednictvím zhášení fluorescence. Molekulární kyslík (O2) je mimořádně účinným zhášečem fluorescence díky svému neobvyklému tripletovému základnímu stavu.

Molekuly, které jsou excitovány absorpcí světla nebo jiným procesem (např. jako produkt reakce), mohou předat energii druhé „senzibilizované“ molekule, která je převedena do svého excitovaného stavu a může pak fluoreskovat. Tento proces se používá ve světelných tyčinkách.

Kvantový výtěžek fluorescence

Kvantový výtěžek fluorescence udává účinnost procesu fluorescence. Je definován jako poměr počtu emitovaných fotonů k počtu fotonů absorbovaných.

Φ = # f o t o n s e m i t e d # f o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\#\ fotony\ emitované}}{\rm {\#\ fotony\ absorbované}}}}.

Maximální kvantový výtěžek fluorescence je 1,0 (100 %); každý absorbovaný foton má za následek emitovaný foton. Sloučeniny s kvantovým výtěžkem 0,10 jsou stále považovány za poměrně fluorescenční. Jiný způsob, jak definovat kvantový výtěžek fluorescence, je pomocí rychlosti rozpadu excitovaného stavu:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

kde k f {\displaystyle {k}_{f}} je rychlost spontánní emise záření a

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

je součet všech rychlostí rozpadu excitovaného stavu. Ostatní rychlosti rozpadu excitovaného stavu jsou způsobeny jinými mechanismy než emisí fotonů, a proto se často nazývají „nezářivé rychlosti“, které mohou zahrnovat:dynamické kolizní zhášení, interakci dipól-dipól v blízkém poli (nebo rezonanční přenos energie), vnitřní konverzi a mezisystémové křížení. Pokud se tedy rychlost některé z cest změní, ovlivní to jak dobu života excitovaného stavu, tak fluorescenční kvantový výtěžek.

Fluorescenční kvantový výtěžek se měří porovnáním se standardem se známou kvantitou; běžným fluorescenčním standardem je chininová sůl, chinin sulfát, v roztoku kyseliny sírové.

Doba života fluorescence

Doba života fluorescence označuje průměrnou dobu, po kterou molekula setrvá ve svém excitovaném stavu, než vyzáří foton. Fluorescence se obvykle řídí kinetikou prvního řádu:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

kde {\displaystyle \left} je koncentrace molekul v excitovaném stavu v čase t {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} je počáteční koncentrace a Γ {\displaystyle \Gamma } je rychlost rozpadu nebo inverzní hodnota doby života fluorescence. Jedná se o případ exponenciálního rozpadu. Různé radiační a neradiační procesy mohou de-populovat exaktní stav. V takovém případě je celková rychlost rozpadu součtem všech rychlostí:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}.

kde Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} je celková rychlost rozpadu, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} je radiační rychlost rozpadu a Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}}. rychlost nezářivého rozpadu. Je to podobné jako u chemické reakce prvního řádu, kde je rychlostní konstanta prvního řádu součtem všech rychlostí (paralelní kinetický model). Pokud je rychlost spontánní emise nebo některá z ostatních rychlostí rychlá, je doba života krátká. Pro běžně používané fluorescenční sloučeniny jsou typické doby rozpadu excitovaného stavu pro fluorescenční sloučeniny, které emitují fotony s energiemi od UV až po blízkou infračervenou oblast, v rozmezí 0,5 až 20 nanosekund. Doba života fluorescence je důležitým parametrem pro praktické aplikace fluorescence, jako je fluorescenční rezonanční přenos energie.

Pravidla

Existuje několik pravidel, která se zabývají fluorescencí. Kasha-Vavilovovo pravidlo nařizuje, že kvantový výtěžek luminiscence nezávisí na vlnové délce budícího záření.

Toto pravidlo neplatí vždy a u mnoha jednoduchých molekul je vážně porušeno. Poněkud spolehlivější tvrzení, i když stále s výjimkami, je, že fluorescenční spektrum vykazuje velmi malou závislost na vlnové délce budícího záření.

Viz též

• Fluorescein
• Fluorescenční lampa
• Světlo
• Fosforescence
• Rentgenové záření

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3. vydání New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Modern Molecular Photochemistry. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molecular Fluorescence: B.: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Všechny odkazy vyhledány 14. dubna 2017.

• Fluorofory.org Databáze fluorescenčních barviv
• Fluorescence na Scienceworld
• Základní pojmy z fluorescence

.