Pozorování oplozených embryí na štěpná embrya
Od roku 1912 byla popsána první kultura králičích embryí a myší zygota mohla být kultivována in vitro za vzniku embryí ve stadiu blastocysty , se kvalita embrya stala důležitým faktorem pro otěhotnění po přenosu embrya in vitro do dělohy, protože kvalita embrya má úzkou souvislost s implantací přeneseného embrya v děloze. Od narození prvního dítěte „ze zkumavky“, Louise Brownové v červenci 1978, za které byla v roce 2010 udělena Nobelova cena za fyziologii nebo medicínu Robertu Edwardsovi za vývoj in vitro fertilizace (IVF) a přenosu embryí (ET) k léčbě neplodnosti u žen s neprůchodnými vaječníky, se produkce embryí in vitro (IVP) široce používá při léčbě neplodnosti u lidí a při reprodukci a rozšiřování populace zvířat. Úspěch technologie asistované reprodukce však závisí především na produkci životaschopných embryí s vysokým potenciálem implantace. A co je ještě důležitější, výběr nejlepšího embrya pro přenos se stal hlavní výzvou při IVF. V počátcích kultivace embryí bylo hodnocení kvality embryí založeno především na morfologických kritériích přenášených embryí. Provádění sériového pozorování morfologie embryí je tedy pro embryology běžnou technikou hodnocení embryí a bylo považováno za klíčový prediktor implantace a těhotenství . Dlouhodobě embryologové prováděli hodnocení kvality a morfologie embryí vyjmutím embryí z inkubátoru a umístěním pod mikroskop. Kromě pozorování morfologie se vědci zajímají o řadu studií týkajících se změn buněčného jádra, aktivace a exprese genů, exprese cytoplazmatických proteinů, diferenciace blastomer atd. Tyto studie však často vedou ke smrti embryí. Například v naší rané studii, která sledovala změnu mikrovřeténka po vstupu spermie do vajíčka nebo aktivaci oocytu, bylo třeba oplodněné zygoty nebo aktivovaná vajíčka fixovat na sklíčku a obarvit imunocytochemicky fluoresceinem a laserovou konfokální mikroskopií . Náš výzkum jasně prokázal změny mikrotubulů a chromatinu po aktivaci hovězího oocytu a introcytoplasmatické injekci spermie (ICSI; obrázek 1). Spermie do oocytu nebo vápníkový ionofor a etanol mohou aktivovat oocyt a způsobit vytlačení druhého polárního tělíska. Abychom mohli sledovat dobu vzniku druhého polárního tělíska, obarvili jsme různá stadia oocytů po aktivaci. Výsledek ukázal, že po 5 hodinách po aktivaci může být druhé polární tělísko zcela vytlačeno (obr. 2).
Obrázek 1.
Laserová skenovací konfokální mikroskopie změn vřeténka a chromatinu v různém čase po aktivaci a intracytoplazmatické injekci spermie (ICSI) u skotu. Velká písmena (vlevo) označují změny po aktivaci a malá písmena (vpravo) po ICSI. A/a ukazuje 0,5 h, B/b jsou 2 h, C/c jsou 3 h a D/d je 7 h po aktivaci nebo ICSI. Prenukleus v aktivovaném vajíčku a prenuclei ve vajíčku ICSI se objevily s červenou barvou.
Obrázek 2.
Laserová skenovací konfokální mikroskopie změn vřeténka a chromatinu v různých časech po aktivaci u skotu. Za 0,5 h po aktivaci se začnou dělit chromozomy vřeténka, k dokončení dělení vřeténka jsou potřeba asi 3 hodiny a druhé polární tělísko může být vytlačeno asi za 5 hodin. Červená a zelená barva společně označují vřeténko a červený bod označuje první polární tělísko.
Studium genové exprese často vyžaduje izolovat mRNA nebo protein z embryí ; proto bylo nutné embrya lyzovat a žádné embryo by nepřežilo. Pro studium buněčné diferenciace na embryích ve stadiu moruly a blastocysty byla použita metoda dvojího barvení fluoresceinovou mikroskopií k rozlišení vnitřní buněčné hmoty (ICM) od trofektodermu (TE). Počty dvou různých buněk lze spočítat na základě různých barev (ICM jako modrá a TE jako růžová, obrázek 3).
Obrázek 3.
Rozlišení různých buněk u embryí hovězí blastocysty pomocí dvojitého barvení. Horní obrázek ukazuje embryo blastocysty s vyznačenou vnitřní buněčnou hmotou (ICM) a okolními buňkami trofektodermu (TE). Spodní obrázek ukazuje dvojitě obarvené bovinní blastocystické embryo s modře označenými buňkami ICM a růžově označenými buňkami TE. Obrázek nahoře pochází z vyhledávání na webových stránkách a autor si velmi váží laskavosti profesora Fulianga Dua, který poskytl nepublikovanou spodní fotografii.
Tyto výzkumné metody nakonec poškozují všechna embrya a není možné je použít v klinické praxi. Současné hodnocení kvality embryí je tedy založeno především na morfologických kritériích transferovaných embryí, která zahrnují tři hlavní parametry, jako je pravidelnost blastomer, fragmentace a cytoplazmatická zrnitost . Pro hodnocení kvality embryí lze také zohlednit počet buněk embrya v různém dni kultivace a vícejadernost . Několik zpráv dokumentuje souvislost mezi morfologickými charakteristikami embryí ve stadiu štěpení a úspěšností těhotenství. V současné době se tedy jedná o základní metodu hodnocení kvality embryí při IVF u lidí a při produkci embryí in vitro u zvířat. Ačkoli se však tato metoda snadno praktikuje, často se při ní embrya vyjmou z inkubátoru, což vede k obavám o bezpečnost a stabilitu kultivačních podmínek . Během pozorování mohou být také přehlédnuty některé klíčové body embryonálního vývoje. Hodnocení štěpných embryí během kultivace a před přenosem embryí je důležitou klinickou praxí. V současné době je hlavním hodnocením embryí oplodněných in vitro vizuální pozorování pomocí mikroskopu. V posledních letech se na lidských klinikách IVF používají různé inkubátory s časosběrnou mikroskopií, které umožňují sledovat všechny kroky růstu a vývoje embryí. Ačkoli se v praxi výběru lidských embryí používají technologie preimplantační diagnostiky a screeningu embryí (PGD/PGS), které mají zlepšit míru otěhotnění, jsou tyto techniky pro embrya invazivní. Nalezení jiné neinvazivní metody výběru dobrého embrya bude v praxi humánní umělé reprodukce velmi užitečné. Sallam a kol. provedli přehled neinvazivních metod pro výběr embryí a zhodnotili tyto metody ve světle nejlepších v současnosti dostupných důkazů, aby zjistili, zda je některá z nich zralá nahradit nebo doplnit léty prověřenou metodu morfologického hodnocení. Potřebujeme tedy výkonnější nástroje pro hodnocení morfokinetických markerů embryí.
2.1. Morfokinetika štěpení embryí založená na časosběrném zobrazování
Po desetiletí se vědci pokoušeli sledovat vývoj mnohobuněčných organismů od oplozených vajíček až po dospělé jedince. Zatímco vědci zkoumali jednotlivé kroky tohoto procesu, neexistovala žádná metoda, která by jim umožnila modelovat celý proces vývoje v přímém přenosu. V současné době pokroky ve světelné mikroskopii popsané ve dvou článcích časopisu Nature Methodspapers umožnily vědcům velmi podrobně vizualizovat raný vývoj . Nejnovější mikroskopy se světelnou vrstvou používají k osvětlení tenkého řezu vzorku laserovou vrstvu světla a zachycují celou rovinu v jednom snímku. To jim umožňuje použít mnohem méně světla než konfokální nebo dvoufotonové mikroskopy. Je velmi rychlý, ale také velmi šetrný, aby mohl mimořádně dobře pracovat ve více kritických směrech najednou . Pro zobrazování vývoje celých embryí, jako jsou embrya drozofil, zebřiček a myší, je tato nová technika vícenásobného zobrazování fantastická.
Časosběrné zobrazování je další neinvazivní, nově vznikající technologie, která umožňuje 24hodinové sledování vývoje embryí a nabízí možnost většího množství a kvality morfologických informací bez narušení kultivačních podmínek . Časosběrný mikroskop je pro pozorování vývoje embrya velmi užitečný. V posledním desetiletí začalo mnoho klinik nebo center pro IVF u lidí používat časosběrné zobrazování ke sledování růstu a dělení embryí během kultivace in vitro a nakonec k výběru kvalitních embryí pro transfer podle zaznamenaných údajů a snímků. Uvádí se, že tato technika dokáže zlepšit implantaci přenesených embryí a těhotenství . Na základě časosběrného záznamu dělení embrya lze určit normální rychlost dělení embrya. Ve druhé kapitole této knihy bylo tedy nastíněno načasování štěpení embrya na základě morfokinetických markerů pomocí časosběrného monitoru. Podle tohoto nástinu časování štěpení embrya mohou embryologové jasně vědět, v jaké fázi by se embryo mělo v různých časových bodech nacházet. K transferu tak může být vybráno embryo optimální kvality nebo embryo s vysokým implantačním potenciálem, aby se dosáhlo vyšší míry těhotenství. Pomocí časosběrného systému kontinuálního a častého záznamu lze v časosběrném systému odhalit některé morfokinetické markery. Například rychlé dělení buněk embrya v daném čase často vede k nižší míře implantace. Za normální situace vyžaduje dělení ze zygoty na 2-3 buňky asi 10-11 hodin času, ale Rubio a kol. zjistili, že některým embryím trvá dokončení tohoto dělení jen asi 5 hodin a tato embrya mají mnohem nižší míru implantace než embrya s normálním dělením (1,2 % oproti 20 %). Také nerovnoměrné rozštěpení embrya, které je definováno jako rozpad jedné blastomery na tři dceřiné blastomery nebo interval buněčného cyklu kratší než 5 hodin, často způsobuje výrazně nižší implantační potenciál . Proto můžeme tyto přesnější morfokinetické markery použít k rozlišení kvality embryí.
Třetí kapitola dále zkoumá a ověřuje, zda je technologie časosběrného zobrazování užitečnější pro výběr „nejkvalitnějších“ embryí pro transfer za účelem zlepšení výsledků ART než konvenční morfologické hodnocení. Zajímavé je, že na základě některých nových výzkumů časosběrných zobrazovacích zařízení byly vyhodnoceny možné korelace mezi pohlavím embrya, fragmentací embrya, protokoly léčby, různými kultivačními médii a morfokinetikou embrya. Dále jsou diskutovány různé algoritmy a prediktivní modely navržené v cyklech ART s časosběrným zobrazováním. Například řada výzkumů rychlosti vývoje zvířecích a lidských embryí pomocí běžného morfologického pozorování ukázala, že samčí embrya rostou rychleji než embrya samičí . Současné pozorování pomocí časosběrného zobrazování však může poskytnout podrobnější a přesnější informace o rozdílech u samčích a samičích embryí během raných dělení. Ačkoli ženská embrya vykazovala morfokinetické parametry pozdního štěpení (t8), moruly (tM) a stádia blastocysty, vykazovala dřívější expanzi než samčí embrya. Klíčové časové body pozorování tedy souvisejí s vývojem pohlaví embrya. Zajímavé je, že autoři navrhli model podle času druhé synchronizace a tvorby moruly se čtyřmi podskupinami, který předpovídá pravděpodobnost, že embryo bude samičí.
Pro další studium a zkoumání morfokinetiky štěpení embryí jsou ve čtvrté kapitole popsány některé metody časoprostorové analýzy štěpení embryí in vitro.Automatizovaná nebo poloautomatizovaná časosběrná analýza snímků raných stadií embrya ve fázi štěpení může poskytnout vhled do načasování mitózy, pravidelnosti načasování i vzoru dělení a také do buněčné linie. Současné sledování molekulárních procesů umožňuje studovat souvislosti mezi genetickou expresí a fyziologií a vývojem buněk. Pomocí časosběrných zobrazovacích dat a analytického softwaru lze snadno vytvořit čtyřrozměrnou videosekvenci embryí, takže rostoucí embrya zobrazují nové poznatky o časovém vývoji embrya. V této kapitole autoři popisují tři metody s variantami hardwaru a softwaru pro analýzu, přičemž uvádějí některé příklady výsledků, které otevírají okno k novým informacím ve vývojové embryologii, protože vzor dělení a linie embrya jsou studovány in vivo.
2.2. Genová exprese štěpného embrya a neinvazivní hodnocení životaschopnosti embrya prostřednictvím analýzy kultivačních médií
Vývoj preimplantačního embrya prochází řadou kritických událostí a pozoruhodných epigenetických modifikací a dochází k přeprogramování genové exprese za účelem aktivace embryonálního genomu. V raných fázích preimplantačního vývoje embrya řídí mateřské mRNA vývoj embrya. V průběhu raného embryonálního vývoje se udržuje diferencovaný metylační vzorec, i když některé vykazují změny specifické pro dané stadium. Nedávné studie ukázaly, že diferenciální proces demetylace má za následek diferenciální expresi mateřských genů v časně se vyvíjejících embryích, která může mít vliv na správný vývoj . Také se ukázalo, že nekódující RNA, dlouhé nekódující RNA (lncRNA) a krátké nekódující RNA, mikroRNA (miRNA), hrají důležitou roli v regulaci mRNA, a proto jejich úloha v preimplantačním vývoji nabyla na významu. Pátá kapitola podává přehled různých faktorů ovlivňujících genovou expresi během preimplantačního vývoje embrya, který zahrnuje epigenetické faktory, se zaměřením na metylační profily, gamet a preimplantačních embryí. Důkladně byl zhodnocen vliv nekódujících RNA na genovou expresi.
Protože se genová exprese objevuje během vývoje embrya v kultuře in vitro, preimplantační embrya často vyžadují kultivační média s bohatou výživou. Embryo během svého růstu a vývoje potřebuje absorbovat některé důležité výživné složky z kultivačního média a metabolicky produkovat některé vedlejší produkty jako výsledky genové exprese. Z tohoto hlediska poskytuje kultivace embryí in vitro také velmi důležitý materiál pro další neinvazivní hodnocení embryí pomocí zkoumání biomarkerů ve spotřebovaném kultivačním médiu embryí. Současné vyvinuté metody se zaměřují na měření metabolických látek vylučovaných z vyvíjejících se embryí. Tyto studie využívají především nástroje moderní analytiky a proteomiky. Některé studie naznačují, že metabolické profilování kultivačních médií embryí pomocí optické a neoptické spektroskopie může být užitečným doplňkem současných strategií hodnocení embryí a poskytnout vhled do fenotypu embryí se zvyšujícím se reprodukčním potenciálem .
V šesté kapitole autoři popisují svůj nový objev, alfa-1 řetězec molekuly lidského haptoglobinu jako kvantitativní biomarker životaschopnosti embryí. V sérii retrospektivních, slepých pokusů dosáhli více než 50% úspěšnosti. Tato kapitola shrnuje v současnosti dostupné metabolické a proteomické přístupy k neinvazivnímu molekulárnímu hodnocení životaschopnosti embryí. Nedávné studie ukázaly, že hodnocení molekulárních složek živných médií je slibnou oblastí při hledání markerů úspěšné implantace embrya s následným rozvojem klinického těhotenství a narozením zdravého dítěte pro zvýšení účinnosti léčby pomocí technik ART . Pokud lze molekulární složení kultivačních médií použít jako další neinvazivní postup pro výběr embrya k selektivnímu přenosu, bude to velmi užitečné pro zlepšení výsledků lidského těhotenství při IVF.