Observación de embriones fecundados a embriones de clivaje
Desde que se describió el primer cultivo de embriones de conejo en 1912 y el cigoto de ratón pudo cultivarse in vitro para formar embriones en fase de blastocisto , la calidad del embrión se ha convertido en un factor importante para el embarazo tras la transferencia del embrión in vitro al útero, ya que la calidad del embrión tiene una estrecha correlación con la implantación del embrión transferido en el útero. Desde el nacimiento del primer bebé «probeta», Louise Brown, en julio de 1978, por el que se concedió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2010 a Robert Edwards por desarrollar la fecundación in vitro (FIV) y la transferencia de embriones (TE) para tratar la infertilidad en mujeres con oviductos no patentes, la producción de embriones in vitro (PIV) se ha utilizado ampliamente en el tratamiento de la infertilidad humana y en la reproducción y expansión de la población animal. Sin embargo, el éxito de la tecnología de reproducción asistida depende principalmente de la producción de embriones viables con alto potencial de implantación. Y lo que es más importante, la elección del mejor embrión para la transferencia se ha convertido en el principal reto de la FIV. En los primeros cultivos de embriones, la evaluación de la calidad del embrión se basaba principalmente en los criterios morfológicos del embrión transferido. Así, la observación seriada de la morfología del embrión es una técnica habitual para que los embriólogos evalúen los embriones y se ha considerado como un predictor clave de la implantación y el embarazo . Durante mucho tiempo, los embriólogos realizaron evaluaciones de la calidad y la morfología de los embriones sacándolos del incubador y colocándolos bajo un microscopio. Además de la observación de la morfología, los investigadores se interesan por una serie de estudios sobre el cambio nuclear de las células, la activación y expresión de los genes, la expresión de las proteínas citoplasmáticas, la diferenciación de los blastómeros, etc. Sin embargo, estos estudios suelen provocar la muerte de los embriones. Por ejemplo, en nuestro primer estudio, en el que se observaba el cambio del microhusillo tras la entrada del espermatozoide en el óvulo o la activación del ovocito, era necesario fijar los cigotos fecundados o los óvulos activados en el portaobjetos y teñirlos con fluoresceína inmunocitoquímica y microscopía confocal láser. Nuestra investigación mostró claramente la alteración de los microtúbulos y la cromatina tras la activación del ovocito bovino y la inyección introcitoplasmática de espermatozoides (ICSI; Figura 1). El espermatozoide en el ovocito o el ionóforo de calcio y el etanol pueden activar el ovocito y causar la extrusión del segundo cuerpo polar. Para observar el tiempo del segundo cuerpo polar, se tiñeron varias etapas de los oocitos después de la activación. El resultado mostró que después de 5 horas de post-activación, el segundo cuerpo polar puede ser completamente extruido (Figura 2).
Figura 1.
Microscopía confocal de barrido láser de los cambios en el huso y la cromatina en los distintos momentos posteriores a la activación y a la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) en bovinos. Las letras mayúsculas (izquierda) indican el cambio posterior a la activación y las letras minúsculas (derecha) indican después de la ICSI. A/a se muestra a las 0,5 h, B/b a las 2 h, C/c a las 3 h y D/d a las 7 h tras la activación o la ICSI. Los prenúcleos en el óvulo activado y los prenúcleos en el óvulo ICSI han aparecido con color rojo.
Microscopía confocal de barrido láser de los cambios en el huso y la cromatina en los distintos momentos posteriores a la activación en bovinos. A las 0,5 horas después de la activación, los cromosomas del huso comienzan a dividirse, y la finalización de la división del huso necesita unas 3 horas y el segundo cuerpo polar puede ser extruido a las 5 horas aproximadamente. El rojo y el verde juntos indican el huso, y el punto rojo indica el primer cuerpo polar.
El estudio de la expresión génica a menudo requiere aislar el ARNm o las proteínas de los embriones; por lo tanto, los embriones necesitan ser lisados y ningún embrión sobreviviría. Para estudiar la diferenciación celular en embriones en fase de moral y blastocisto, se ha utilizado un método de doble tinción con microscopía de fluoresceína para distinguir la masa celular interna (MCI) del trofoectodermo (TE). El número de dos células diferentes puede contarse basándose en diferentes colores (MCI como azul y TE como rosa, Figura 3).
Distinción de diferentes células en embriones de blastocisto bovino con doble tinción. La figura superior muestra un embrión de blastocisto con la masa celular interna (MCI) marcada y alrededor de las células del trofectodermo (TE). La figura inferior muestra un embrión de blastocisto bovino con doble tinción con azul como MCI y rosa como células de TE. La imagen superior procede de la búsqueda en la página web, y el autor agradece enormemente la cortesía del profesor Fuliang Du por la foto inferior no publicada.
Estos métodos de investigación finalmente dañan todos los embriones, y es imposible aplicar estos métodos a la práctica clínica. Por lo tanto, la evaluación actual de la calidad de los embriones se basa principalmente en los criterios morfológicos de los embriones transferidos, que incluyen tres parámetros principales como la regularidad de los blastómeros, la fragmentación y la granularidad citoplasmática . Además, el número de células del embrión en diferentes días de cultivo y la multinuclearidad pueden considerarse para evaluar la calidad del embrión. Varios informes han documentado la asociación entre las características morfológicas de los embriones en fase de clivaje con el éxito de la gestación. Por lo tanto, éste es actualmente el método básico para la evaluación de la calidad embrionaria en la FIV humana y en la producción de embriones in vitro en animales. Sin embargo, aunque se practica con facilidad, con frecuencia se sacan los embriones de la incubadora, lo que genera preocupaciones por la seguridad y la estabilidad de las condiciones de cultivo. Además, algunos puntos clave del desarrollo embrionario pueden perderse durante la observación. La evaluación de los embriones de escisión durante el cultivo y antes de la transferencia embrionaria es una práctica clínica importante. Actualmente, la principal evaluación de los embriones fecundados in vitro es la observación visual mediante microscopía. En los últimos años, se están utilizando varios incubadores de microscopía de lapso de tiempo en la clínica de FIV humana para supervisar todos los pasos del crecimiento y el desarrollo del embrión. Aunque las tecnologías de diagnóstico y cribado embrionario preimplantacional (PGD/PGS) se han aplicado en la práctica de la selección de embriones humanos para mejorar la tasa de embarazo, estas técnicas son invasivas para los embriones. Encontrar otro método no invasivo para seleccionar un buen embrión será muy útil en la práctica de las TRA humanas. Sallam et al. revisaron los métodos no invasivos para la selección de embriones y evaluaron estos métodos a la luz de las mejores pruebas disponibles en la actualidad para averiguar si alguno de ellos está maduro para sustituir o complementar el método de evaluación morfológica consagrado. Así, necesitamos herramientas más potentes para estimar los marcadores morfocinéticos de los embriones.
2.1. Morfocinética de escisión del embrión basada en imágenes de lapso de tiempo
Durante décadas, los investigadores han intentado seguir el desarrollo de los organismos multicelulares desde los huevos fertilizados hasta los adultos. Aunque los científicos habían explorado los pasos individuales de este proceso, no existía ningún método que les permitiera modelar todo el proceso de desarrollo en vivo. En la actualidad, los avances en la microscopía de lámina de luz, recogidos en dos artículos de Nature Methods, han permitido a los investigadores visualizar el desarrollo temprano con gran detalle. Los microscopios de lámina de luz más recientes utilizan una lámina de luz láser para iluminar una fina sección de una muestra y capturar todo el plano en una sola instantánea. Esto les permite utilizar mucha menos luz que los microscopios confocales o de dos fotones. Es muy rápido, pero también muy suave, para actuar de forma extremadamente buena en múltiples aspectos críticos al mismo tiempo. Para obtener imágenes del desarrollo de embriones enteros como los de Drosophila, pez cebra y ratones, esta nueva técnica de obtención de imágenes multivista es fantástica.
La obtención de imágenes de lapso de tiempo es otra tecnología emergente no invasiva que permite monitorizar el desarrollo de los embriones durante las 24 horas del día, ofreciendo la posibilidad de aumentar la cantidad y la calidad de la información morfológica sin perturbar las condiciones de cultivo . El microscopio de lapso de tiempo es muy útil para la observación del desarrollo embrionario. En la última década, muchas clínicas o centros de FIV humana han comenzado a utilizar la imagen de lapso de tiempo para supervisar el crecimiento y la división del embrión durante el cultivo in vitro y, finalmente, para seleccionar un embrión de buena calidad para la transferencia de acuerdo con los datos de registro y las imágenes. Se ha informado de que esta técnica puede mejorar la implantación del embrión transferido y el embarazo. Basándose en el registro del tiempo de escisión del embrión, se puede determinar la velocidad normal de escisión del embrión. Por lo tanto, en el segundo capítulo de este libro, se ha esbozado el momento de la división del embrión basándose en los marcadores morfocinéticos mediante el monitor de lapso de tiempo. De acuerdo con este esquema del momento de clivaje del embrión, los embriólogos pueden saber claramente en qué fase debe encontrarse un embrión en distintos momentos. De este modo, se puede seleccionar para la transferencia un embrión de calidad óptima o un embrión de alto potencial de implantación para obtener una mayor tasa de embarazo. Utilizando un sistema de grabación continua y frecuente, se pueden revelar algunos marcadores morfocinéticos en el sistema de lapso de tiempo. Por ejemplo, la rápida división de las células del embrión en un momento dado suele dar lugar a una menor tasa de implantación. En la situación normal, la división del cigoto en 2-3 células requiere unas 10-11 horas de tiempo, pero Rubio et al. descubrieron que algunos embriones sólo emplean unas 5 horas en completar esta división, y estos embriones tienen una tasa de implantación mucho menor que los embriones de división normal (1,2% frente al 20%). Además, la división desigual del embrión, que se define como una abrupción de un blastómero en tres blastómeros hijos o un intervalo de ciclo celular inferior a 5 horas, suele producir un potencial de implantación significativamente menor. Por lo tanto, podemos utilizar estos marcadores morfocinéticos más precisos para distinguir la calidad del embrión.
El tercer capítulo examina y verifica además si la tecnología de imágenes de lapso de tiempo es útil para la selección de embriones de «máxima calidad» para la transferencia con el fin de mejorar el resultado de las TRA en lugar de la evaluación morfológica convencional. Se han evaluado las posibles correlaciones entre el sexo del embrión, la fragmentación del embrión, los protocolos de tratamiento, los diferentes medios de cultivo y la morfocinética del embrión, basándose en algunas nuevas investigaciones sobre las instalaciones de imágenes de lapso de tiempo. Además, también se discuten varios algoritmos y modelos predictivos diseñados en ciclos de TRA con imágenes de lapso de tiempo. Por ejemplo, muchas investigaciones sobre la velocidad de desarrollo de los embriones animales y humanos mediante la observación morfológica ordinaria mostraron que los embriones masculinos crecen más rápido que los femeninos. Sin embargo, la observación actual de imágenes de lapso de tiempo puede proporcionar información más detallada y exacta sobre la diferencia en los embriones masculinos y femeninos durante las primeras divisiones. Aunque los embriones femeninos mostraron parámetros morfocinéticos de escisión tardía (t8), mórula (tM) y estadio de blastocisto, presentaron una expansión más temprana que los machos. Así pues, los puntos temporales clave de observación están relacionados con el desarrollo del género del embrión. Curiosamente, los autores diseñaron un modelo en función del momento de la segunda sincronía y de la formación de la mórula con cuatro subgrupos para predecir la probabilidad de que un embrión sea femenino.
Para seguir estudiando y explorando la morfocinética de la división del embrión, en el cuarto capítulo se analizan algunos métodos de análisis espaciotemporal de la división del embrión in vitro.El análisis automatizado o semiautomatizado de las imágenes de las primeras fases del embrión durante la fase de clivaje puede proporcionar información sobre el momento de la mitosis, la regularidad del momento y el patrón de división, así como sobre el linaje celular. El seguimiento simultáneo de los procesos moleculares permite estudiar las conexiones entre la expresión genética y la fisiología y el desarrollo celulares. Gracias a los datos de las imágenes de lapso de tiempo y al software de análisis, se puede crear fácilmente una secuenciación de vídeo cuatridimensional de los embriones, de modo que los embriones en crecimiento muestran nuevos conocimientos sobre el desarrollo temporal del embrión. En este capítulo, los autores describen tres métodos con variaciones en el hardware y el software de análisis dando algunos ejemplos de los resultados para abrir una ventana a la nueva información en la embriología del desarrollo, como el patrón de división del embrión y el linaje se estudian en vivo.
2.2. Expresión génica del embrión de clivaje y evaluación no invasiva de la viabilidad del embrión mediante el análisis del medio de cultivo
El desarrollo del embrión de preimplantación experimenta una serie de eventos críticos y modificaciones epigenéticas notables, y se produce una reprogramación de la expresión génica para activar el genoma embrionario. En las primeras etapas del desarrollo embrionario de preimplantación, los ARNm maternos dirigen el desarrollo embrionario. A lo largo del desarrollo embrionario temprano, se mantiene un patrón de metilación diferencial, aunque algunos muestran cambios específicos para cada etapa. Estudios recientes han demostrado que el proceso de desmetilación diferencial da lugar a una expresión diferencial de los genes paternos en los embriones de desarrollo temprano que puede tener un impacto en el correcto desarrollo . Asimismo, se ha demostrado que los ARN no codificantes, los ARN largos no codificantes (lncRNA), y los ARN cortos no codificantes, los microARN (miRNA), desempeñan un papel importante en la regulación de los ARNm, por lo que su función en el desarrollo preimplantatorio ha cobrado importancia. En el capítulo cinco se revisan los diferentes factores que afectan a la expresión génica durante el desarrollo embrionario preimplantatorio, entre los que se incluyen los factores epigenéticos, centrados en los perfiles de metilación, de los gametos y los embriones preimplantatorios. Se evaluaron a fondo los efectos de los ARN no codificantes en la expresión génica.
Debido a la aparición de la expresión génica durante el desarrollo del embrión en el cultivo in vitro, los embriones de preimplantación suelen requerir medios de cultivo ricos en nutrición. El embrión durante su crecimiento y desarrollo necesita absorber algunos componentes nutritivos importantes del medio de cultivo y producir metabólicamente algunos subproductos como resultados de la expresión génica. Desde este punto de vista, el cultivo in vitro de embriones también proporciona un material muy importante para la posterior evaluación no invasiva del embrión mediante el examen de biomarcadores en el medio de cultivo del embrión gastado. Los métodos desarrollados actualmente se centran en la medición de los compuestos metabólicos secretados por los embriones en desarrollo. Estos estudios utilizan principalmente las herramientas de la analítica moderna y la proteómica. Algunos estudios sugieren que la elaboración de perfiles metabólicos de los medios de cultivo de embriones mediante espectroscopias ópticas y no ópticas puede ser un complemento útil de las estrategias actuales de evaluación de embriones y proporcionar información sobre el fenotipo de los embriones con mayor potencial reproductivo.
En el sexto capítulo, los autores describen su nuevo descubrimiento, la cadena alfa-1 de la molécula de haptoglobina humana como biomarcador cuantitativo de la viabilidad del embrión. En una serie de experimentos retrospectivos y a ciegas lograron un porcentaje de éxito superior al 50%. Este capítulo resume los enfoques metabólicos y proteómicos actualmente disponibles como evaluación molecular no invasiva de la viabilidad del embrión. Estudios recientes han demostrado que la evaluación de los componentes moleculares de los medios de cultivo es un área prometedora en la búsqueda de marcadores de implantación embrionaria exitosa con el subsiguiente desarrollo de un embarazo clínico y el nacimiento de un bebé sano para mejorar la eficiencia del tratamiento mediante técnicas de TRA . Si la composición molecular de los medios de cultivo se puede utilizar como un procedimiento adicional no invasivo para elegir un embrión para la transferencia selectiva, será muy útil para mejorar el resultado del embarazo humano de FIV.