Análisis neurogenético del trastorno desintegrativo infantil

Sujetos de estudio

Las características clínicas de la cohorte de TDC y el número de sujetos examinados por cada modalidad de estudio se muestran en la Tabla 1. La proporción de sexos de 3,25 hombres por cada mujer es similar a la reportada para el TEA. La media y la mediana de edad al inicio de los síntomas fue de 46 y 40 meses, respectivamente, con un rango de 28 a 84 meses. El 70% de los sujetos experimentaron un pródromo de ansiedad y terror. El 30% de los sujetos tuvo múltiples episodios de regresión. La duración del primer episodio regresivo osciló entre 2 meses y casi 7 años en un sujeto. La mayoría de los sujetos tienen una ID de severa a profunda, siendo la media y la mediana del CI de 30 y 26, respectivamente, con un rango de 8 a 74. Todos tenían pérdida de habilidades lingüísticas, pérdida de habilidades sociales o de comportamiento adaptativo, y pérdida de habilidades de juego. El 65% tenía pérdida de control de esfínteres y la misma proporción tenía pérdida de habilidades motoras. Aunque se ha informado de que el TDC es casi siempre esporádico, algunos de nuestros sujetos tienen familiares directos con TEA o rasgos autistas, incluyendo dos pares de gemelos monocigóticos. Ambos miembros de una pareja (CDD13-03/04) tienen CDD; en la otra pareja (CDD20-03/04), uno tiene CDD y el otro tiene TEA.

Genética

Dada la rareza, la gravedad y la transmisión aparentemente esporádica que se observa en la mayoría de los casos de CDD, planteamos la hipótesis de que las variantes raras de gran efecto contribuyen a la etiología. De hecho, hay abundantes pruebas de la contribución de variantes raras al TEA. Como se muestra en la Tabla 2, encontramos una o más variantes raras para todos los probandos menos uno, que no fueron compartidas por ningún control de hermanos no afectados (Archivo adicional 2: Tabla S2). También buscamos variantes heterocigotas compuestas en los sujetos mediante la búsqueda de variantes adicionales en los genes afectados por las variantes de novo, pero no encontramos ninguna. Las tasas de todas las variantes de novo de alta probabilidad (puntuación de calidad bayesiana ≥ 50) fueron de 0,80/exoma de banda y 0,92/exoma de hermano (archivo adicional 2: tabla S3), que son similares a las tasas generales calculadas a partir de 11 estudios recientes de WES sobre trastornos del neurodesarrollo: 1,00/exoma de banda, n = 2358; 0,82/exoma de control, n = 731 . No hubo diferencias significativas en las tasas de variantes no sinónimas de novo, homocigóticas y hemicigóticas (archivo adicional 2: tabla S3); la tasa de genes expresados en el cerebro afectados; las puntuaciones de conservación del valor P filogenético (PhyloP) en las posiciones de las variantes; las puntuaciones de intolerancia a la variación residual (RVIS); y las puntuaciones de fenotipado del polimorfismo v2 (PolyPhen-2) (archivo adicional 2: tabla S2) entre los probandos y los hermanos.

Encontramos una CNV genérica de novo en un probando (0,07/probanda, Tabla 2), que es similar a las tasas informadas previamente para ASD , y ninguna en los hermanos. La NVC del probando es una deleción heterocigota de 2 kb del 3′UTR de OGDHL, que codifica un componente de un complejo proteico mitocondrial implicado en la neurodegeneración. Un gen, SUPT20HL2, y dos familias de genes, USP y BBS, están afectados en más de un probando CDD. Se identificaron dos variantes de sentido erróneo en SUPT20HL2, que codifica un factor de transcripción putativo pero que podría ser un pseudogén según la base de datos UniProtKB (http://www.uniprot.org/). Tres miembros de la familia de genes USP (peptidasa específica de la ubiquitina) están afectados en los probandos de CDD: USP9X (hemizygous missense), USP9Y (paternally-inherited non-sense), y USP26 (hemizygous missense). Codifican enzimas deubiquitadoras que impiden la degradación de las proteínas. Dos miembros de la familia de genes del Síndrome de Bardet-Biedel (BBS), que participan en la ciliogénesis, tienen variantes de novo con sentido erróneo en los probandos de CDD: BBS5 y BBS9. Aunque las variantes específicas que cambian la proteína identificadas en los sujetos con DCC eran raras y no se habían asociado previamente con la enfermedad, revisamos la literatura y encontramos cierto solapamiento entre los genes candidatos a DCC y los genes potencialmente asociados con otros trastornos neurológicos (Tabla 2).

No había variantes claramente deletéreas en los sujetos con DCC. Para identificar variantes potencialmente patogénicas, consideramos una combinación de factores: (1) expresión cerebral positiva, (2) puntuación PhyloP ≥ 1,30 (P = 0,05 para la conservación), (3) RVIS negativo (gen intolerante a la variación), y (4) clasificación PolyPhen-2 de missense probablemente perjudicial (o n/a debido a una variante distinta de missense). De los 47 genes candidatos a CDD, 14 cumplían todos estos criterios: NRK, TBC1D8B, TRRAP, NAV2, OGDHL, ZNF236, PRKCSH, MTMR8, BCOR, SRPK3, USP9Y, KIAA2018, CXorf57 y ALG13 (Tabla 2). Para afinar aún más esta lista, la inspección de los datos de secuenciación del Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) reveló que (1) las variantes en todos los genes, excepto NAV2, MTMR8 y ALG13, son nuevas o se encuentran como máximo una vez en el conjunto de datos y (2) entre los 11 genes restantes, 4 se encuentran entre el 5% más intolerante: TRRAP, ZNF236, BCOR, y KIAA2018.

TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein)afectado por una variante de novo con sentido erróneo en un varón probando CDD; codifica un componente de los complejos de histona acetiltransferasa y está implicado en la transcripción y reparación del ADN. No está asociada a un trastorno OMIM, pero se han identificado variantes de novo en otros trastornos neurológicos (Tabla 2). ZNF236 (Zinc Finger Protein 236) también está afectada por una variante de novo con sentido erróneo en un varón probando; puede estar implicada en la regulación transcripcional (UniProtKB) pero no está asociada con un trastorno conocido. BCOR (BCL6 Corepressor) está afectado por una variante de sentido erróneo hemicigótica en un varón probando CDD; codifica un corepresor transcripcional. Se asocia con microftalmia sindrómica, que puede tener el rasgo de ID pero que por lo demás no caracteriza al probando CDD y suele estar causada por mutaciones de truncamiento en las mujeres. KIAA2018 está afectado por una deleción homocigótica de un aminoácido en un probando masculino de CDD; también se conoce como USF3 (upstream transcription factor 3). No está asociada a un trastorno OMIM, pero se han identificado variantes de novo en otros trastornos neurológicos (Tabla 2). Cabe destacar que todos estos genes candidatos principales desempeñan un papel o pueden estar implicados en la transcripción, lo que caracteriza también a muchos genes asociados al TEA.

Usando el conjunto de datos del transcriptoma humano BrainSpan exon-array , trazamos la mediana del nivel de expresión de los genes candidatos al TDC como grupo para todas las regiones cerebrales disponibles desde las etapas embrionarias hasta la edad adulta tardía (n = 40 genes representados una vez en el conjunto de sondas principales, Archivo adicional 2: Tabla S4). Como muestra el perfil de expresión de la Fig. 1, los genes candidatos a CDD se expresan en mayor medida en las regiones no neocorticales en comparación con las regiones neocorticales a lo largo de la vida (archivo adicional 2: tabla S5). Además, hay niveles crecientes de expresión en el AMY, el STR y el HIP durante los períodos 10 (1-6 años de edad) y 11 (6-12 años de edad), el rango que abarca la edad de inicio de los síntomas en nuestra cohorte CDD.

Dada esta observación, comparamos la diferencia en la mediana de los niveles de expresión entre las regiones no neocorticales y neocorticales para los genes afectados por variantes no sinónimas y sinónimas en los probandos CDD, sus hermanos no afectados y los probandos de TEA de la Colección Simons Simplex (SSC) con y sin regresión emparejados por sexo, edad en la evaluación, coeficiente intelectual y gravedad de los síntomas de autismo (véase el archivo adicional 1: Información suplementaria para los detalles de la selección de la cohorte). El perfil de expresión de los genes candidatos a CDD es cualitativamente distinto de los otros conjuntos de genes, excepto que es similar al perfil de los genes afectados por variantes no sinónimas en los probandos de SSC con regresión, a pesar de que sólo tienen un gen, NAV2, en común (Fig. 2, Archivo adicional 2 : Tablas S4 y S6). La diferencia de expresión, no neocortical menos neocortical, alcanza un valor positivo máximo en las etapas medias del feto. Para los genes candidatos a CDD, esto ocurre en el periodo seis; las pruebas de permutación con 100.000 iteraciones de 40 genes seleccionados al azar del conjunto de datos BrainSpan confirmaron la importancia de esta expresión diferencial (P = 0,0022). Ampliamos el análisis a otros conjuntos de genes, como los identificados en probandos del CET y hermanos no afectados con variantes no sinónimas, sinónimas y LGD; los genes más significativamente asociados con el TEA por tres grandes estudios recientes de WES y CNV; y todos los genes del conjunto de datos BrainSpan. El perfil de expresión de los genes afectados por variantes no sinónimas en los probandos CDD y SSC con regresión es cualitativamente distinto de estos otros conjuntos también (Archivo adicional 1: Figura S1, Archivo adicional 2: Tablas S4 y S6).

También investigamos si los genes candidatos a CDD se coexpresan entre sí. De los 40 genes candidatos, 11 se coexpresan con al menos otro gen candidato en todas las regiones cerebrales y períodos de tiempo con un coeficiente de correlación de Pearson r ≥ 0,7 (Fig. 3, archivo adicional 2: Tabla S7). Hay 23 conexiones de este tipo, con una media de 2,09 correlaciones/gen y un coeficiente medio de 0,779. Las pruebas de permutación con 100.000 iteraciones de 40 genes seleccionados al azar del conjunto de datos BrainSpan revelaron que observar 11 genes con al menos 2,09 correlaciones/genes es significativo (P = 0,036), al igual que observar 11 genes con un coeficiente de correlación medio de al menos 0,779 (P = 0,019). Cumplir ambos umbrales también es significativo (P = 0,0059). Dado que los 11 genes candidatos a CDD que se coexpresan entre sí tienen una expresión cerebral positiva según el conjunto de datos de BrainSpan, también se realizaron pruebas de permutación con 100.000 iteraciones con 40 genes expresados en el cerebro seleccionados al azar de BrainSpan. Mientras que la observación de 11 genes con al menos 2,09 correlaciones/genes no es significativa (P = 0,066), la observación de 11 genes con un coeficiente de correlación medio de al menos 0,779 es significativa (P = 0,022) al igual que el cumplimiento de ambos umbrales (P = 0,011). La comparación del conjunto de 11 genes candidatos a CDD coexpresados con el conjunto restante de 29 que no están coexpresados no reveló diferencias significativas entre la tasa de genes expresados en el cerebro, las puntuaciones PhyloP o las puntuaciones PolyPhen-2; sin embargo, los genes coexpresados son significativamente más intolerantes a la variación (RVIS media -1,42 frente a -0,15, t(35) = -2,91, P = 0,0062, prueba t independiente, de dos colas). El análisis de enriquecimiento de la ontología de genes utilizando la Base de Datos de Anotación, Visualización y Descubrimiento Integrado v6.8 (https://david.ncifcrf.gov/) para todo el conjunto de genes candidatos a CDD, y el subconjunto de 11 genes coexpresados no identificó un enriquecimiento significativo de los términos GO después de la corrección de Benjamini-Hochberg de los valores P.

Sistemas neuronales

Dada la universalidad de los déficits sociales en el TEA, la disfunción en los sistemas cerebrales que subsisten la percepción social, incluyendo la percepción de las caras, es un foco clave de la investigación del TEA. Los estímulos visuales de caras y casas activan y disocian de forma fiable los sistemas implicados en el procesamiento de la información socioemocional (caras temerosas) y no socioemocional (casas). Estudiamos cuatro cohortes: CDD (n = 7), LFASD (n = 7), HFASD (n = 14) y TD (n = 19). Aunque los individuos con LFASD son más numerosos que los que tienen CDD, el tamaño de nuestra muestra seguía estando limitado por la dificultad de obtener datos de neuroimagen (y de seguimiento ocular) de alta calidad en sujetos de bajo funcionamiento. Dicho esto, hasta donde sabemos, esta es la primera presentación de datos de fMRI sin sedación de individuos con TEA y marcada ID.

No hubo diferencias significativas en el sexo, la edad, el volumen intracraneal y el movimiento de la cabeza en el escáner entre las cuatro cohortes. Los grupos CDD y LFASD tampoco fueron significativamente diferentes según el CI y la gravedad del autismo, y los grupos HFASD y TD no fueron significativamente diferentes según el CI (Archivo adicional 2: Tablas S8 y S9). En primer lugar, utilizamos una muestra de descubrimiento de 12 de nuestros 19 sujetos con TD en un análisis de todo el cerebro para una localización independiente de las regiones de interés implicadas en el procesamiento de las caras en relación con las casas. La figura 4a ilustra las regiones de la corteza occipitotemporal ventrolateral en las que los sujetos con TD mostraron una activación significativa de las caras > las casas (archivo adicional 2: tabla S10). Estas regiones incluyeron las ubicaciones esperadas de los nodos conocidos de la red occipitotemporal sensible a la cara, incluyendo el área de la cara fusiforme y el área de la cara occipital . Como se muestra en la Fig. 4b y en el archivo adicional 2: Tabla S11, la extracción del porcentaje medio de cambio de señal (caras > casas) para cada uno de los cuatro grupos indicó una ausencia de diferencias de grupo en la respuesta a las caras frente a las casas en estas regiones de interés definidas de forma independiente al comparar los grupos TD:validación y HFASD y al comparar los grupos LFASD y CDD . La respuesta a las caras > casas dentro del grupo de TDC no fue significativamente mayor que cero, lo que sugiere una falta general de sensibilidad a las caras en la red occipitotemporal sensible a las caras en su conjunto. Existe un hallazgo bien establecido de hipoactivación a las caras (frente a las casas) en la circunvolución fusiforme derecha y media en HFASD en relación con la TD. Hemos podido replicar este hallazgo en nuestras cohortes. Sin embargo, la comparación de las caras > la actividad de las casas en CDD en relación con TD no reveló ninguna diferencia significativa , al igual que la comparación de los grupos LFASD y TD (archivo adicional 1: Figura S2 y archivo adicional 2: Tabla S12).

Dada la posible falta de sensibilidad a las caras en la corteza occipitotemporal ventrolateral en CDD, a continuación se realizó una evaluación de todo el cerebro de los sujetos CDD para localizar los sustratos neuroanatómicos de la percepción de la cara en estos individuos. Como se ilustra en la Fig. 5a, los sujetos con TDC mostraron actividad de las casas de las caras en la circunvolución frontal media, la circunvolución precentral, el caudado (estriado), el tálamo, el hipocampo y el cerebelo (Archivo adicional 2: Tabla S13). Estas regiones se solapan con las regiones cerebrales que tienen los niveles más altos de expresión de genes candidatos a CDD (Fig. 1). Como se muestra en la Fig. 5b y en el archivo adicional 2: Tabla S14, la comparación del porcentaje medio de cambio de señal (caras > casas) de estas regiones de interés reveló una diferencia significativa entre CDD y HFASD , pero ninguna diferencia significativa entre CDD y LFASD . El grupo LFASD mostró un fenotipo intermedio al de los grupos HFASD y CDD (Fig. 5b).

Comportamiento de la mirada

Recogimos datos de seguimiento ocular para cuantificar el fenotipo social de nuestras cuatro cohortes mientras veían caras emocionales . Como se muestra en el archivo adicional 2: Tablas S15 y S16, los grupos no fueron significativamente diferentes por sexo, edad y duración total de la fijación en la imagen. Los grupos CDD y LFASD tampoco fueron significativamente diferentes según el CI y la gravedad del autismo, y los grupos HFASD y TD no fueron significativamente diferentes según el CI. Como se muestra en la Fig. 6, replicamos los hallazgos anteriores de una menor fijación en los ojos y una mayor fijación en la boca en el HFASD en relación con el TD. Sin embargo, mientras que el porcentaje de tiempo que los sujetos con LFASD pasaron mirando los ojos no difirió significativamente del grupo HFASD , los sujetos CDD fijaron los ojos significativamente más que el grupo HFASD . Comparados entre sí, los sujetos CDD y LFASD no difirieron significativamente en el tiempo dedicado a mirar a los ojos . Al igual que los resultados de la fMRI (Fig. 5b), el grupo LFASD mostró un fenotipo intermedio al de los grupos HFASD y CDD (relación ojo-boca, Archivo adicional 2: Tabla S16).

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